Emulsification spontanée.

 D. Bonn J. Meunier, N. Shahidzadeh (postdoc), collaboration O. Aguerre-Chariol, M. Nabavi, M. Airiau, M. Morvan, (Rhodia Recherches)

L'émulsification est le processus qui à partir d'eau, d'huile et d'un ou plusieurs tensioactifs, permet d'obtenir une émulsion dans laquelle l'huile et l'eau sont finement divisées. Il nécessite généralement beaucoup d'énergie, car une très grande quantité d'interface est formée. Un tensioactif abaisse cette énergie en abaissant la tension interfaciale. L'émulsification étant un processus industriel très répandu, l'industrie s'intéresse beaucoup aux tensioactifs permettant une émulsification spontanée, sans apport extérieur d'énergie.

N. Shahidzadeh a entrepris une étude du processus d'émulsification spontanée observé lorsqu'une solution d'AOT dans de la saumure est placée en contact d'un alcane. Cette étude a été réalisée par microscopie à contraste de phase et par cryo-microscopie électronique. Comme il a déjà été dit ci-dessus, les solutions d'AOT ne contiennent pas de micelles, mais des vésicules géantes. Ces vésicules géantes, visibles en microscopie optique à contraste de phase, ont permis de suivre le processus d'émulsification, car elles permettent d'avoir une trace des tensioactifs en solutions.

Une première étude avait concerné l'émulsification spontanée autour d'une petite goutte d'alcane injectée dans une solution d'AOT de faible concentration (peu au-dessus de la CMC) afin de ralentir les processus et les rendre plus facilement observables. Plusieurs processus ont été observés dont un nouveau très efficace. Les vésicules d'AOT se collent à l'interface eau/huile, leurs bicouches incorporent de l'huile et deviennent instables. Ces vésicules chargées d'alcane éclatent (comme des bulles de savon) et dispersent des micro gouttelettes d'huile chargées d'AOT (100-10000Å) dans la solution aqueuse : il se forme une émulsion de façon spontanée.

En, pratique les concentrés émulsionnables vendus pour l'agriculture ou d'autres usages sont des solutions dans une huile de surfactants et des produits traitants (insecticides etc.). Ce sont ces concentrés qui sont mis en contact d'eau et s'émulsifient spontanément. Cela a amené cette équipe à faire une étude similaire à la précédente, mais en mettant en contact toujours sous microscope de la saumure avec une petite goutte d'huile dans laquelle cette fois est dissous l'AOT. Cette étude a montré que l'AOT dans l'huile forme des vésicules en présence de traces d'eau et que ces vésicules en rencontrant l'interface eau/huile se vident violemment de leur contenu en huile qui est pulvérisé dans la phase aqueuse. Les gouttelettes obtenues par ce nouveau processus sont plus grosses que précédemment, de l'ordre du micron.

Ces études ont jusqu'à présent permis d'identifier trois paramètres-clés concernant l'émulsification spontanée: l'architecture moléculaire, le diagramme de phase à l'équilibre du mélange initial et la qualité du solvant. Néanmoins, ces travaux ne représentent qu'un début de compréhension de l'émulsification spontanée. En effet, l'émulsification spontanée est un phénomène qui se déroule très loin de l'équilibre thermodynamique. Dans ces conditions, il n'y a pas un mécanisme universel, mais plusieurs mécanismes possibles qui restent largement à identifier et à préciser. Malgré son intérêt pratique, peu de travail a été réalisé dans ce domaine à cause de la complexité des phénomènes dynamiques en jeu.

Langmuir 16, (2000) 9703

Références.

A new mechanism of spontaneous emulsification : relation to surfactant properties, N. Shahidzadeh, D. Bonn, J. Meunier, Europhys.Lett. 40 (1997) 459

Spontaneous emulsification: relation to micro-emulsion phase behaviour, N. Shahidzadeh, D. Bonn, O. Aguerre-Chariol, J. Meunier, Coll. Surf., 147 (1999) 375

Dynamics of spontaneous emulsification for fabrication of oil in water emulsions, N. Shahidzadeh, D. Bonn, J. Meunier, M. Nabavi, M. Airiau, M. Morvan, Langmuir 16, 9703 (2000)

Transition vers un état lié dans une phase lamellaire inverse induite par des inclusions..

W. Urbach, N. Taulier, collaboration R.Ober du L.M.C. ( Collège de France UMR), M. Waks (LIP UMR 7623 Univ. Paris VI) & Y. Yip (Hunter Collège, New York.)

Très tôt cette équipe s'est tournés vers l'étude de systèmes complexes : les mélanges tensioactif-polymère, (ou biopolymère nécessitant une collaboration interdisciplinaire). L'addition de polymères (ou de particules colloïdales) aux phases organisées de tensioactifs modifie considérablement leurs propriétés physiques et donne lieu à des phénomènes nouveaux et intéressants. L'objet de ces travaux est l'étude des interactions entre les inclusions induites par des membranes et des interactions entre les membranes induites par des inclusions. Un but est de contrôler la stabilité et la topologie des phases par incorporation des molécules de charge et architecture variées.

Le comportement d'une phase lamellaire inverse a été étudié en présence de diverses inclusions. La phase lamellaire est composée d'un empilement de lamelles séparées par du dodécane. Chaque lamelle est formée de deux monocouches d'un tensioactif non-ionique entourant une faible épaisseur d'eau. Dans une telle phase la répulsion entre les lamelles, due aux interactions stériques, équilibre les forces attractives de Van der Waals et la distance d entre les lamelles est inversement proportionnelle à leur fraction volumique. Les inclusions ont une de structure triblocs hydrophile / hydrophobe / hydrophile. trois types d'inclusions ont été étudiés

Le premier type (protéine ou peptides) possèdent dans sa partie centrale une hélice a hydrophobe, rigide. Les deux blocs hydrophiles de ces molécules s'ancrent dans deux bicouchent ce qui forme l'équivalent de boutons-pression en rapprochant localement les lamelles voisines. On observe une expulsion de dodécane hors de la phase lamellaire, accompagnée d'une diminution de la période interlamellaire, d, avec la concentration d'inclusions C : d ‰ C-0.5. Ce comportement s'explique en supposant que les longueurs d'onde des fluctuations des lamelles sont limitées par la distance moyenne entre les boutons-pression. L'équipe a également démontré que la présence des boutons-pression ne change pas de façon significative la rigidité des lamelles et que la compressibilité de la phase lamellaire dépend de la longueur hydrophobe du bouton-pression.

La formation de bouton-pression n'est pas systématique, mais dépend de la structure des inclusions.

Dans un deuxième type d'inclusions étudiées, la partie centrale de l'inclusion est composée d'une simple chaîne aliphatique.Le phénomène de bouton-pression n'a alors jamais été observé. Aucun changement n'apparaît lorsque les molécules triblocs sont ajoutés. Lorsqu'un motif hydrophile est inséré dans la chaîne aliphatique centrale, une diminution de la période interlamellaire apparaît. Ce résultat est interprété en considérant que la molécule bolaforme s'insère dans les monocouches de tensioactif.

Les molécules qui possèdent dans leur partie centrale une hélice a hydrophobe, agissent comme des boutons-pression en rapprochant localement deux lamelles voisines. On observe une expulsion de dodécane hors de la phase lamellaire, accompagnée d'une diminution de la période interlamellaire, d avec la concentration d'inclusions

Le troisième type d'inclusions est constitué des polymères triblocs dont les dimensions sont supérieures à la distance interlamellaire. Le comportement d'un tel système, plus complexe, n'a pas encore été complètement élucidé.

Transition vers l'état lié dans des bicouches directes.

W. Urbach, N. Tsapis (thèse), collaboration avec R.Ober du (L.M.C. du Collège de France) M. Waks du (LIP Univ. Paris VI) Y. Yip (Hunter Collège, New York.)

Des situations conduisant à une transition vers un état lié dans des membranes gonflées à l'eau (bicouches directes) n'ont pas encore pu être observés. On conçoit l'intérêt de la maîtrise de ces phénomènes en thérapie vectorisée.

L'équipe a essayé d'induire une telle transition dans ces systèmes en utilisant des peptides neutres spécialement synthétisés spécialement par Y. Yip. Le phénomène de bouton pression n'est pas observé car le peptide se couche sur la membrane. Pour l'éviter, de nouvelles tentatives vont être faites en chargeant légèrement la membrane par inclusion de tensioactifs ioniques et en utilisant un peptide chargé afin que membranes et peptides se repoussent

Potentiel d'interaction entre les inclusions membranaires.

W. Urbach, N. Taulier (thèse), collaboration T. Gulik (C.G.M. Gif/Yvette), Y. Dunant (Centre médical universitaire, Genève)

La membrane est un élément qui joue un rôle essentiel pour la fonction et le comportement des protéines membranaires (ou transmembranaires). En particulier, outre les interactions classiques directes entre les protéines membranaires, la membrane crée des interactions spécifiques "indirectes" qui sont souvent responsables de l'agrégation des protéines. Deux principaux mécanismes ont été suggérés. Le premier provient de la différence entre l'épaisseur de la membrane et la hauteur de la protéine. Les lipides membranaires doivent s'adapter à la taille de la protéine, modifiant ainsi la forme de la membrane aux alentours. Le stress subi par la membrane sera minimisé par une réorganisation des protéines, ce qui se traduit par une interaction entre celles-ci. Dans le second mécanisme, ce sont les fluctuations thermiques des membranes qui induisent une interaction latérale entre les protéines. Si le premier mécanisme a déjà été vérifié expérimentalement, le second ne l'avait pas été. L'équipe a donc décidé d'étudier les forces latérales entre les protéine afin d'apporter une preuve expérimentale a l'existence des forces dues aux fluctuations thermiques membranaires dont l'étude n'est pas une chose aisée. En effet, il n'existe aucun appareil spécifiquement étudié pour permettre leur mesure. Cependant la cryofracture permet de visualiser la distribution des protéines sur la membrane et cette distribution dépend directement des interactions entre les protéines. Plusieurs modèles donnent une relation théorique entre le potentiel d'interaction et la fonction de distribution des protéines. Cette méthode requiert la microscopie électronique et une parfaite maîtrise de la technique de cryofracture. Les expériences ont donc été réalisée en collaboration Gulik-Krzywicki (Gif-sur-Yvette, France) spécialiste international dans ce domaine.

Le travail a commencé par l'étude d'une protéine transmembranaire, le protéolipide de la myéline, dans une phase lamellaire stabilisée par des les fluctuations thermiques. Il a été montré que pour une épaisseur de membrane supérieure à la taille de la protéine, les forces sont répulsives et d'origine purement électrostatique. Lorsque l'épaisseur de la membrane est inférieure à la taille de la protéine une force attractive est observée en plus des interactions électrostatiques. L'équipe a démontré que cette force est bien due aux fluctuations de la membrane et que le potentiel expérimental résultant est en accord avec le modèle de Netz et Pincus (PRE 1996) décrivant les interactions entre les protéines dues aux fluctuations membranaires dans une phase lamellaires. De plus, il a été montré que les interactions électrostatiques suivent un comportement exponentiel du type Poisson-Bolztmann. Ce résultat est loin d'être évident, en effet les protéines membranaires se meuvent sur une membrane, c'est à dire sur un objet a 2 dimensions. Par conséquent toutes les expressions usuelles des interactions classiques (électrostatiques, van der Waals...) utilisées dans des systèmes à 3 dimensions n'ont a priori plus cours ici. De plus, les modèles théoriques existant sont en désaccord sur la forme que devraient prendre ces forces bidimensionnelles.

Lorsque l'épaisseur de la membrane est < taille des protéines, en plus de l'interaction électrostatique, on observe une force attractive entre les inclusions. Le potentiel d'interaction attractif déduit est en excellent accord avec un modèle d' interactions entre les inclusions induites par la fluctuation thermiques de la membrane. Ces résultats prédits par des théories n'avaient jamais été observés auparavant.

 

Ce travail se poursuit actuellement en collaboration avec le Pr. Yves Dunant (Centre médical universitaire, Genève).L'objet est de comprendre l'activation des protéines intra-membranaires, IMP, (en particulier des protéolipides médiatophores) dans les terminaisons présynaptiques du nerf, lorsqu'une impulsion nerveuse est envoyée. Dans un travail préliminaire (Bugnard et al. soumis a Eur. J. Neurosciences), l'étude de la distribution des IMP sur la membrane a permis de mettre en évidence une différence importante dans la répartition des tailles des IMP au repos et après application d'un signal. L'équipe a montré que ce changement de taille n'influait pas sur les interactions entre les IMP.

Films monomoléculaires à la surface de l'eau, microscopie à l'angle de Brewster :

J. Meunier, C. Lheveder (thèse) collaboration R. Mercier (Institut d'Optique, Orsay)

Le premier microscope ("microscope à l'angle de Brewster") permettant la visualisation des transitions de phases dans les films monomoléculaires, en l'absence d'impuretés fluorescentes, conçu et réalisé au laboratoire au début des années 90 par J. Meunier en collaboration avec S. Hénon (thèse) est sensible à de très faibles variations de densité ou d'épaisseur (~1Å) d'un film ainsi qu'à son anisotropie optique car il utilise les propriétés de l'angle de Brewster pour lequel la réflectivité d'un interface est nulle si celui-ci est parfait (interface de Fresnel). Cependant, cet appareil utilise une optique de microscope classique qui doit être inclinée à l'angle de Brewster pour recevoir la lumière réfléchie et diffusée par le film étudié. L'image n'est alors au point que le long d'une ligne. Il faut faire un grand nombre d'images le long de lignes cote à cote de la surface pour obtenir une image nette sur toute la surface étudiée en reconstituant celle-ci sur ordinateur par juxtaposition de ce grand nombre d'images. Ceci prend un temps non négligeable (2.5s environ) qui limite les études à des problèmes de dynamique très lente.

Une collaboration avec R. Mercier, de l'Institut d'Optique et un contrat DRET a permis de construire un nouveau microscope à Brewster ne présentant pas les défauts du modèle initial grâce au calcul et à la réalisation d'une optique spécialisée. Il permet en particulier de prendre des images à la vitesse vidéo car il ne nécessite plus de balayage de la surface et présente une excellente résolution (mieux que le micron). Cette optique a été livrée en décembre 1996. Elle a été montée et testée en 1997 et a permis d'aborder un premier problème de dynamique dans les films de Langmuir (thèse de C. Lheveder). Avec cet appareil, il a été montré que l'étalement à la surface de l'eau d'une goutte de solution d'un acide gras dans un solvant volatil induit une orientation préférentielle de l'inclinaison des molécules dans le film de Langmuir formé après évaporation.(article en préparation)

Références :

A new Brewster angle microscope, C. Lheveder, S. Hénon, R. Mercier, G. Tissot, P. Fourney, J. Meunier, Rev. Sci. Instr. 69 (1998) 1446

Why a Brewster angle microscope ? J. Meunier, Coll. Surf. A171 (2000) 33

Brewster angle microscopy and ellipsometry, S. Hénon, J. Meunier, in " modern characterization methods of surfactant systems ", Ed. B.P. Binks, Chapitre 4 (1999) p109-145. Marcel Dekker (N.Y.)

Brewster angle microscopy, C. Lhedever, S. Hénon, J. Meunier, in Physical chemistry of biological interfaces ; A. Baszkin,W. Norde Eds. (chapitre 16), Marcel Dekker (Novembre 1999) pp 559-575

Projets.

Avec le nouveau microscope, les images étant prises a la fréquence vidéo, la mobilité des films à la surface de l'eau n'est plus un facteur limitant. Il devient alors envisageable de réaliser une détection ellipsométrique qui au lieu de donner une image qualitative de la surface donnera une carte quantitative des propriétés optiques de cette surface.

Les études physiques projetées concernent l'interaction écoulement/texture dans les films de mésophases, les fluctuations géantes des lignes de défauts observées lors de la compression de certaines phases et l'organisation des films de Gibbs en formation lors d'une transition de phase (collaboration S. Rivière-Cantin, Université de Cergy-Pontoise) 

Alcanes semi-fluorés sur phospholipides.

O. Abillon, collaboration avec Marie-Pierre Kraft (Institut Charles Sadron, Strasbourg).

Les phospholipides sont bien connus pour former des films de Langmuir à la surface de l'eau. Ces monocouches modélisent très schématiquement une demi-membrane de cellule biologique. Comprendre leur interaction avec d'autres composés est d'un grand intérêt pour la biophysique. Par réflectivité de rayons X, la structure du film de Langmuir composé de phospholipides et d'alcanes semi-fluorés a pu être déterminée. A faible pression, la partie hydrogénée des alcanes semi-fluorés est interpénétrée avec la partie aliphatique des phospholipides ; la partie fluorée étant orientée vers le haut, donc vers l'air. Lorsque la pression augmente, les alcanes semi-fluorés sont éjectés progressivement de la couche de phospholipides.

Alcanes semi-fluorés à l'interface eau/air.

O. Abillon, collaboration avec le groupe d'Abdel el Abed (laboratoire Objets complexes et interface d'intérêt biologique à l'Université Paris V).

Bien que totalement hydrophobes, certaines molécules d'alcanes semi-fluorés forment des films de Langmuir stables à la surface de l'eau. Le but de ce travail est la détermination de la structure de ces films et compréhension. Les deux techniques principalement utilisées sont la réflectivité des rayons X et la mesure du potentiel de surface. Deux phases d'un type nouveau ont été mises en évidence. A basse pression de surface, les molécules sont verticales et tête-bêche, bien que les alcanes fluorés ne soient pas miscibles avec les alcanes hydrogénés. Le fort moment dipolaire électrique à la jonction entre la partie fluorée et le reste de la molécule permet d'expliquer cette stabilité : il y a formation d'une phase 2D de type anti-ferroélectrique. À plus haute pression, les alcanes semi-fluorés forment une bicouche, les parties fluorées étant tournées vers l'extérieur et les parties hydrogénées étant plus ou moins imbriquées à l'intérieur de la bicouche. Une étude plus approfondie de la compétition entre les forces de Van der Waals, favorisant l'appariement des parties fluorées entre elles, et les forces électrostatiques, favorisant plutôt une structure tête-bêche est prévue en mesurant l'effet de la longueur des segments fluorés et hydrogénés dans la molécule. L'étude de l'effet d'un champ électrique sur la structure est aussi envisagée.

Référence.

Air-water interface-induced smectic bilayer, A. El Abed, E. Pouzet, M-C. Fauré, M. Sanière, and O. Abillon, Phys. Rev.E 62 (2000). R5895

Mesure du profil de polymères greffés à la surface de l'eau.

O. Abillon, collaboration Pierre Muller (Centre de recherche sur les macromolécules à Strasbourg).

Des théories sur les polymères en brosse, les poly-électrolytes greffés, etc… existent mais les mesures expérimentales sont très souvent difficiles du fait d'un contraste trop faible entre le solvant et le polymère. Dans cette étude, le poly-électrolyte est le polyvinyl-pyridine ancré à du polystyrène. Hélas, aux concentrations intéressantes, le contraste en réflectivité de rayons X est trop faible : seuls ont été observés le film formé par les ancres et la totalité du film à grande compacité lorsque la mesure du profil n'est pas intéressante.

Etude de films de Langmuir-Blodgett d'acide béhénique sur silicium.

O. Abillon, collaborations Françoise Perrot et Sophie Cantin-rivière (Laboratoire de Physique des Matériaux et des Surfaces, Université de Cergy-Pontoise).

Le but de cette étude est de caractériser la structure de ces couches (3, 5 ou 11 couches déposées par la méthode de Langmuir-Blodgett) et en particulier de mieux localiser les ions Cadmium présents ente les têtes polaires. La technique de réflectivité X se prête très bien à ce genre de mesure. Les courbes de réflectivité ont été obtenues avec une très grande précision. Pour l'instant aucun modèle simple ne permet d'interpréter totalement les résultats expérimentaux, même si les aspects principaux sont compris.

Adsorption d'une protéine globulaire modèle, le lysozyme, à la surface de l'eau ; structure et cinétique.

 O. Abillon, C. Postel (thèse), collaboration Bernard Desbat (laboratoire de Spectroscopie moléculaire et cristalline , Université de Bordeaux).

Mieux comprendre le phénomène d'adsorption des protéines aux interfaces est un enjeu majeur en biophysique, en médecine ou dans l'industrie alimentaire ; il est aussi intéressant de comparer l'adsorption des protéines, polymères bien définis, aux théories existantes. Or ce phénomène est encore mal connu. Pour une protéine globulaire modèle très étudiée comme le lysozyme, certains pensent qu'il n'y a pas dénaturation lors de l'adsorption à la surface de l'eau alors que d'autres pensent que la protéine se dénature. De plus certains auteurs ont rapporté l'existence d'un retard important à l'adsorption. Une étude approfondie s'imposait.

Le profil d'adsorption est étudié par la mesure de la réflectivité des rayons X (raie Ka du cuivre à 1,54 Å). L'analyse des courbes de réflectivité a permis de montrer que :

1) Les profils d'adsorption ne dépendent pas de la concentration en protéines dans la gamme étudiée (7 à 100 µg/ml).

2) Dans une solution de lysozyme totalement dénaturé par la présence d'urée et de dithiothreitol (DTT, pour casser les ponts disulfures) dans la solution, le profil d'adsorption suit une loi d'échelle en z&emdash;4/3, qui est attendue pour un polymère souple. Totalement dénaturé, le lysozyme se comporte bien comme un polymère classique.

3) Sous un film hydrophile (de l'acide oléique à la surface de l'eau) le lysozyme conserve sa structure globulaire : étant soluble, il est normal qu'en milieu hydrophile la protéine conserve sa structure.

4) En revanche, la protéine pure ou partiellement dénaturée par l'urée (sans ajout de DTT, il reste donc les ponts disulfures) a des profils d'adsorption assez semblables ; ces profils sont proches mais différents d'un profil "polymère" en z&emdash;4/3, et ils ne correspondent pas non plus à un film de protéines non dénaturées. Le lysozyme se dénature donc partiellement en s'adsorbant à l'interface eau/air. Des mesures de spectroscopie infrarouge de la surface par la méthode PMIRRAS, en collaboration avec Bernard Desbat du laboratoire de Spectroscopie moléculaire et cristalline à Bordeaux, ont confirmé ce fait : la plupart des hélices a disparaissent au profit de feuillets b.

Les mesures de réflectivité X, bien que très précises, sont trop lentes pour étudier la cinétique d'adsorption. Celle-ci a donc été étudiée par ellipsométrie. Une technique de vases communicants a été utilisée pour mesurer un éventuel temps de retard : un nouvel interface eau/air est ainsi créé sans protéines adsorbées à l'instant initial. Les problèmes liés aux techniques d'injection sous la surface sont ainsi évités. Aucun temps de retard n'a été détecté pour les concentrations de lysozyme étudiées (de quelques µg/ml à 200 µg/ml). Deux régimes dynamiques ont été mis en évidence (le régime dit limité par la diffusion n'a pas pu être observé à ces concentrations sauf peut-être sur des temps très courts). Un régime classique exponentiel aux temps courts, lorsque la couverture de la surface reste inférieure à environ 50&emdash;60% (le rythme d'adsorption est proportionnel à la surface restante d'où l'exponentielle) et un régime lent lorsque la couverture de la surface dépasse 60&emdash;70%. Ce régime lent est interprété par le mécanisme suivant : bien que la surface libre restante soit, au total, importante, les surfaces libres élémentaires sont de taille insuffisante pour permettre l'adsorption d'une nouvelle protéine (dans le cas d'adsorption irréversible de disques sur un substrat solide, la limite entre les deux régimes n'est que de 50%!), l'adsorption est alors limité par une dynamique de "réarrangement" à la surface qui permet l'apparition de surfaces élémentaires libres suffisamment grandes.

Cette transition dans la dynamique d'adsorption mérite d'être approfondie, à la fois expérimentalement et théoriquement, par des simulations numériques par exemple. Comme la modélisation du processus d'adsorption des protéines est rendu délicate par le phénomène de dénaturation, des molécules sphériques rigides assez grosses en taille et fonctionnalisées pourraient être utilisées : le savoir-faire existe.

Référence.

Adsorption of Lysozyme and Methylated Lysozyme at the Air-Water Interface: An X-ray Reflectivity Study, C. Postel, O. Abillon, Langmuir 14 (1998) 5649

Micromanipulation de molécule unique d'ADN.

J.-F. Allemand, and V. Croquette, D.  Bensimon, T. Strick, collaboration C. Bouchiat, M. D. Wang, S. M. Block, D.  Dohmi, and M.  Mézard. (LPT de l'ENS)

En utilisant de simples aimants et en attachant à l'une des extrémités de la molécule une microbille magnétique tandis que l'autre est fixée à une paroi de verre, cette équipe réalise des expériences de micromanipulation sur une molécule d'ADN. Cette technique permet des contraintes d'étirement et de torsion jamais atteintes à ce jour. La figure donne le schéma de principe de l'expérience.

Afin d'effectuer les mesures de force nécessaires, cette équipe a mis au point une nouvelle technique de mesure basée sur l'étude du mouvement brownien de la bille magnétique placée dans le gradient de champ des aimants qui permet d'appliquer une force et une torsion à la molécule d'ADN (méthode décrite dans le précédant rapport d'activité). Largement inspirée de la méthode proposée par Einstein pour mesurer la raideur d'un ressort elle permet la mesure de forces dans la gamme de quelques picoNewtons, bien adaptée au problèmes étudiés.

Il est nécessaire de vérifier que la bille étudiée n'est reliée à la surface du capillaire que par une seule molécule d'ADN. Pour cela, on mesure la courbe d'élasticité correspondant à la molécule en faisant varier la force appliquée (en bougeant les aimants) sur celle-ci et en déterminant son allongement. En faisant varier la force depuis quelques dizaines de femtoNewtons jusqu'à quelques picoNewtons, l'extension de la molécule varie depuis une valeur presque nulle jusqu'à une extension quasi totale de la molécule (c'est-à-dire la longueur cristallographique).

La courbe force/extension d'une molécule d'ADN est très bien décrite par le modèle du ver (Worm Like Chain en anglais) pour lequel on peut écrire une formule approchée très précise [Bouchiat 98]. Cette courbe dépend de deux paramètres : la longueur cristallographique L0 de la molécule et la longueur de persistance x du polymère. Pour la structure ADN-B dans des conditions ioniques de 10 mM de tampon phosphate, x vaut 50 nm. Comme la longueur de la molécule d'ADN étudiée est connue, il est facile de prédire exactement l'allure de la courbe force/extension et de la comparer aux résultats expérimentaux : l'accord est très bon.

Principe de l'expérience : les molécules d'ADN sont introduites dans un capillaire disposé sur un microscope inversé. Des aimants réglables en hauteur et pouvant tourner sur eux-mêmes permettent d'appliquer une contrainte de traction et de torsion sur la molécule par l'intermédiaire d'une microbille magnétique. Une caméra CCD reliée à un ordinateur enregistre les déplacements de la bille. (agrandissement) L'ADN est fixé à la bille recouverte de streptavidine par son extrémité biotinilée et à la surface recouverte d'antidigoxigénine par son autre extrémité traitée a la digoxigénine. (Photo issue de Biofutur ). Les échelles des différents composants ne sont pas respectées; en effet, le diamètre de la bille est de l'ordre de 3µm tandis que les aimants font quelques mm

 

Lorsque la force de traction sur la molécule d'ADN est augmentée au delà de 10 pN, les liaisons chimiques se déforment d'abord faiblement puis une transition brutale apparaît pour une force ª 70 pN : la molécule devient presque deux fois plus longue [Cluzel et al, 96]. Cette transition correspond à l'apparition d'une nouvelle phase de la molécule : l'ADN-S dont deux structures possibles ont été proposées.

Références.

Estimating the persitence length of a worm-like chain molecule from force-extension measurements, C. Bouchiat, M. D. Wang, S. M. Block, J.-F. Allemand, T. Strick, and V. Croquette;. Biophysical Journal, 76 (1999) 409.

Stretching a heteropolymer, D.  Bensimon, D.  Dohmi, and M.  Mézard. Europhys. Lett., 42 (1998) 97

L'élasticité d'une molécule d'ADN soumise à une contrainte de torsion.

J-F. Allemand, T. Strick, D. Bensimon, V. Croquette,T.R. Strick.

Les pièces polaires de l'aimant produisent un champ magnétique dont la direction est perpendiculaire à la direction d'extension de la molécule d'ADN. Il est ainsi possible de faire tourner la direction du champ en gardant constante la force appliquée, simplement en faisant tourner les aimants. La bille magnétique présente une direction de facile aimantation, et suit donc fidèlement la direction du champ, comme le ferait une boussole. Comme la molécule d'ADN est attachée à la bille en plusieurs points, la rotation de la bille contrôle la torsion de la molécule d'ADN. En tournant les aimants on tord la molécule d'ADN. Évidemment, pour que cette contrainte de torsion existe, il faut non seulement que la molécule soit attachée en plusieurs points à la surface du verre mais surtout qu'elle ne présente aucun nick, c'est-à-dire aucune coupure simple brin.

Courbes de l'extension relative en fonction du degré de surenroulement à force constante. Elles ont été baptisées "courbes en chapeau" du fait de leur forme à basse force.

 

L'effet de la torsion sur une molécule d'ADN est très important au niveau de la cellule. En effet, une batterie d'enzymes, les topoisomérases, régulent le degré de torsion de l'ADN, tant chez les bactéries que dans nos cellules. Si on bloque l'action de ces enzymes, on tue la cellule. Dans toutes les cellules qui vivent à température ordinaire, l'ADN présente une contrainte de torsion négative, c'est-à-dire que la molécule est un peu sousenroulée. Par contre, l'ADN des bactéries vivant dans les sources chaudes (70ºC et plus) présente, lui, un léger surenroulement. La contrainte de torsion est donc un paramètre biologique important. Pour la caractériser, on compare le nombre de tours n ajoutés ou enlevés à la molécule au nombre de tours Lk0 que présente la double hélice en l'absence de contrainte, à savoir un tour toutes les 10.5 paires de bases. Le rapport de ces deux nombres s= n/Lk0 permet de comparer des molécules de taille différente. Dans les expériences réalisée au laboratoire, les molécules d'ADN sont de deux types, les plus courtes sont composées de 17000 paires de bases (bp) soit Lk0 = 1600, tandis que les plus longues possèdent 48502 bp soit Lk0 = 4600.

L'effet de la torsion sur une molécule d'ADN a été étudié avec soin par White, il se comprend facilement si on tord un tube de caoutchouc. En tordant le tube régulièrement et en maintenant une force de traction, celui-ci accepte cette contrainte mais il y oppose un couple qui est proportionnel à l'angle dont on l'a tordu. Si maintenant, la traction sur le tube est relachée tout en maintenant l'angle de torsion constant, une instabilité ne tarde pas à apparaître sous forme de "tortillons", bien connu sur les fils des combinés téléphoniques. Lorsque ces tortillons se forment, le couple de torsion diminue de façon notable. Les tortillons absorbent une part importante de la torsion. En fait, l'apparition de cette instabilité est, comme il se doit, le résultat d'une compétition entre deux mécanismes : l'énergie mécanique du tube de caoutchouc se répartit entre une contribution de torsion pure et une contribution de courbure. Pour de petites contraintes de torsion, le tube reste droit afin de minimiser son énergie de courbure. Pour de fortes contraintes, il devient rentable de se courber afin de réduire le couple de torsion et donc l'énergie de torsion. A l'échelle de la molécule d'ADN, les bilans énergétiques sont presque équivalents, il faut seulement ajouter de grandes fluctuations thermiques qui adoucissent l'apparition de l'instabilité d'entortillements (encore appelés plectonèmes). Ces tortillons produisent un raccourcissement de la molécule. Ainsi, en appliquant une faible force sur une molécule d'ADN et en portant l'allongement de celle-ci en fonction du nombre de tours qui lui sont appliqués, on observe une courbe en cloche. L'extension est maximale lorsque aucune contrainte de torsion n'est appliquée, et diminue quand la contrainte de torsion augmente et ce, quelque soit son signe. Ce comportement correspond à la courbe symétrique de la figure qui est en excellent accord avec les prédictions théoriques.

Lorsque l'expérience est répétée avec une force de traction plus importante (de 1 pN), un comportement dissymétrique en fonction de s est observé. Pour s > 0, la molécule se raccourcit comme précédemment, en revanche, pour s < 0, la longueur de la molécule ne semble plus dépendre de s. Ce changement de comportement est encore plus net sur les courbes de force/extension réalisées à s constant. Dès que s est assez négatif, l'extension de la molécule présente une transition abrupte depuis une valeur nulle jusqu'à l'extension maximale et ceci pour une force typique de 0.5 pN. Cette dissymétrie relative au signe du degré de torsion est prévisible puisque la molécule d'ADN est chirale et que par conséquent, surenrouler n'est pas équivalent à sousenrouler. Cette transition correspond à l'apparition d'une "bulle de dénaturation". En sousenroulant la double hélice, on provoque l'apparition d'une petite région où les liaisons hydrogène qui maintiennent les bases complémentaires des deux brins cèdent sous la contrainte.

En augmentant encore la force de traction sur l'ADN, un phénomène identique du coté des s > 0 est aussi observé. Au delà de 3 pN, l'extension de la molécule d'ADN devient quasiment insensible à s. Cette transition correspond également à l'apparition locale d'une nouvelle phase de l'ADN discutée plus loin.

Revenons à l'étude de l'ADN sousenroulé, et imaginons que l'on puisse mesurer le couple qui s'exerce sur la molécule; on comprend aisément que lorsque la molécule reste complètement allongée, ce couple augmente linéairement avec le nombre de tours dont on déroule la double hélice, et que l'énergie de torsion augmente, elle, de façon quadratique avec le nombre de tours appliqués, soit en s2. Au niveau de sa structure, la molécule présente une certaine élasticité qui lui permet d'accommoder, sur toute sa longueur, un pas hélical légèrement différent de son pas naturel (10.5 bp par tour). La constante de torsion de l'ADN-B est importante mais le couple disponible au niveau de la bille magnétique est très fort. Il est ainsi possible de soumettre la molécule à des contraintes redoutables. Or, si l'on détord une corde formée de plusieurs torons, ceux-ci ont tendance à se désolidariser; le même phénomène se produit pour l'ADN-B : au delà d'un couple critique, l'énergie de torsion accumulée à chaque tour devient plus grande que l'énergie qu'il faut pour dénaturer l'ADN-B c'est-à-dire pour casser les liaisons hydrogène qui relient les deux brins. Par ailleurs, lorsque les brins sont dénaturés, ils n'ont plus besoin de s'enrouler l'un autour de l'autre, ils peuvent rester simplement parallèles. Ainsi, une bulle de dénaturation ne présente pas d'enroulement naturel comme l'ADN-B et, en apparaissant, permet de réduire la contrainte de torsion appliquée à la molécule. Un petit calcul d'ordre de grandeur permet d'estimer que le couple critique pour lequel la première bulle de dénaturation apparaît, correspond à s =-0.015. Cela signifie que la molécule d'ADN-B ne peut pas tolérer une contrainte telle que son pas hélical soit augmenté de plus de 1,5% !

Que se passe-t-il quand on continue à dérouler la molécule ? C'est à cette question que l'équipe du LPS a tenté de répondre en explorant la courbe force/extension d'une molécule, pour des valeurs de s variant depuis 0 jusqu'à -1. Les courbes de force évoluent continûment au fur et à mesure que s diminue. On peut, en fait, décrire toutes ces courbes comme la combinaison linéaire des deux courbes obtenues à s = 0 et à s = -1. On écrit ainsi : Ls(F) = a L(s=-1)(F) + (1 - a) L(s=0)(F) . De plus, on peut vérifier que a = -s . A l'échelle de la courbe de force, le couple critique de s = -0.015 n'est pas distinguable de s = 0 . L'évolution des courbes de force avec s s'interprète ainsi par l'augmentation régulière de la longueur des bulles de dénaturation. En effet, la courbe de force de l'ADN-B (s = 0) est différente de celle de l'ADN dénaturé (s = -1 ), ce qui permet une évolution continue pour -1 < s < 0. En particulier, à haute force (10 pN), l'ADN dénaturé est sensiblement plus long que l'ADN-B : la longueur d'une molécule d'ADN sous une traction de 10 pN augmente donc linéairement avec -s. Cette transition est l'équivalent d'une transition de phase du premier ordre (par exemple liquide/gaz) en fonction d'une contrainte (équivalente au volume). Elle a ici lieu sur une molécule unique et à une dimension et n'est sans doute pas stricto-sensus du premier ordre mais suffisamment brusque pour apparaître comme telle.

Évidemment, avec les seules mesures d'élasticité, on ne peut pas garantir que la molécule d'ADN présente effectivement des bulles de dénaturation lorsqu'elle est sousenroulée. Pour vérifier cette hypothèse, l'équipe a réalisé des expériences complémentaires qui ont confirmé le modèle. La première série correspond à la possibilité d'hybrider un morceau d'ADN simple brin sur l'un des brins de la bulle de dénaturation. Cette technique permet, grâce à la préparation d'un morceau d'ADN ayant un code spécifique, d'assurer que la bulle de dénaturation s'est ouverte à un endroit défini. La deuxième série d'expériences est moins précise mais s'applique aussi à la phase d'ADN apparaissant sous contrainte de surenroulement. On choisi un composé chimique, le glyoxal, qui altère les bases de l'ADN non impliquées dans une liaison hydrogène avec une base complémentaire. Le glyoxal modifie les bases d'ADN qui font partie d'une bulle de dénaturation sans altérer celles qui font partie de la molécule double brin.

En sousenroulant une molécule soumise à une force de traction plus grande que 1 pN , une bulle de dénaturation est rapidemment ouverte. Le glyoxal est alors introduit dans la cellule expérimentale et on laisse agir ce composé pendant quelques dizaines de minutes, afin de réaliser une attaque chimique des bases dénaturées. La contrainte de torsion est alors ramenée à zéro, le glyoxal est rincé et l'attaque chimique est mise en évidence. Pour cela, on réalise une mesure de l'extension de la molécule en fonction de s à une faible force; si aucune attaque chimique n'a eu lieu, on retrouve une courbe symétrique comme celle de la figure 2, possédant un maximum marqué à s = 0 . Après une attaque au glyoxal sur une bulle de dénaturation, on obtient cette fois une courbe dissymétrique, présentant du coté des s < 0 , un plateau où l'extension est maximale. Le signal est identique dans le cas de l'expérience d'hybridation. L'interprétation de cette courbe est la suivante : du coté s > 0, la molécule se comporte comme avant l'attaque, le surenroulement produit des plectonèmes qui raccourcissent la molécule. Du coté s < 0, ce raccourcissement ne se fait qu'après avoir déroulé la molécule d'un nombre de tours un peu inférieur à celui dont elle était déroulée lors de l'attaque au glyoxal. En effet, les bases de la bulle, modifiées chimiquement, ne forment plus de bonnes liaisons hydrogène. Dès que la molécule est sousenroulée, elle se dénature, même à faible force, relâchant ainsi la contrainte de torsion. Lorsque toutes les bases altérées se sont dénaturées, la contrainte de torsion peut à nouveau augmenter et la molécule se raccourcit en formant des plectonèmes. Ainsi, le plateau observé permet de déterminer aisément le nombre de bases chimiquement modifiées par le glyoxal. On obtient que ce plateau est, en nombre de tours, sensiblement égal à celui dont on a sousenroulé la molécule lors de l'attaque. Ceci confirme l'augmentation de la longueur des bulles de dénaturation avec la contrainte de sousenroulement appliquée.

Références.

The behavior of supercoiled DNA, T. R., Allemand, J. F., Bensimon, D. & Croquette, V. Biophys. J. 74 (1998) 2016.

Homologous pairing in streched supercoiled DNA, Strick, T. Strick, V. Croquette and D. Bensimon, Proc. Nat. Acad. Sci. (USA) 95 (1998) 10579.

Physical approaches to the study of DNA., T. Strick, J.-F. Allemand, V. Croquette, and D. Bensimon, J. Stat. Phys. 93 (1998) 647.

Micro-mechanical measurement of the torsional modulus of DNA, T. R. Strick, D. Bensimon and V. Croquette, proceedings of NATO ARW on "Structural Biology and Functional Genomics", (1998), Genetica, 106, 57-62 (1999).

Le surenroulement conduit à l'apparition d'une nouvelle structure de l'ADN

 J.-F. Allemand, D. Bensimon, R. Lavery, V. Croquette, T. R. Strick.

L'existence de bulles de dénaturation était déjà connue pour des molécules d'ADN sousenroulées. La grande surprise fut de découvrir l'existence d'une transition vers une nouvelle structure de la molécule lorsque celle-ci est surenroulée. En effet, on applique à une molécule une force de traction supérieure à 3 pN, et si on la surenroule régulièrement, on observons également une évolution continue des courbes de force avec s, caractéristique d'une partition de la molécule entre deux phases.

Les contraintes de torsion appliquées deviennent très importantes puisque s atteint la valeur de 3, ce qui signifie que l'on a augmenté le nombre de tours de la molécule d'un facteur 4! Encore une fois, les courbes de force peuvent toutes être décrites par une combinaison linéaire de la courbe à s = 0 et de celle à s = 3. Pour cette valeur de la contrainte torsionnelle, la longueur de la molécule tend vers 0 lorsque la force de traction appliquée est inférieure à 25 pN. En revanche, lorsque la force est supérieure à 25 pN , la longueur de la molécule devient nettement plus grande que celle de la phase B. En fait, pour F < 25 pN la nouvelle phase de la molécule d'ADN (qui sera appelée ADN-P) présente sans doute des entortillements qui sont responsables du raccourcissement de la molécule. Lorsque la force de traction atteint 25 pN, ces entortillements disparaissent et la phase d'ADN-P présente alors sa vraie longueur. Pour rendre compte de ces résultats expérimentaux, il faut que la phase ADN-P présente 2.6 paires de bases par tour et que sa longueur soit 1.75 fois plus grande que celle de l'ADN-B.

Structure d'une même molécule d'ADN sous les deux formes : en haut la double hélice de l'ADN-B, en bas la nouvelle phase appelée ADN-P déduite grâce à la modélisation moléculaire. Cette représentation décrit l'encombrement des atomes constituant ici une double chaîne de 18 bases GC. Les squelettes phosphodiesters sont coloriés en pourpre tandis que les bases de guanine sont en bleu et celles de cytosine sont en jaune, les atomes d'oxygène ionisés, eux, sont en rouge. Ces modèles ont été réalisés grâce au programme JUMNA, en imposant une contrainte de torsion et une géométrie hélicoïdale sur la séquence de bases.

Les modélisations moléculaires réalisés sur ordinateur, grâce au programme JUMMA, permettent de prédire la structure de l'ADN-P. L'énorme torsion que présente cette phase oblige les bases à se désappareiller pour que les liens phosphodiesters puissent se rapprocher, comme on peut le voir sur la figure.. Cette structure n'est pas sans rappeler la structure de l'ADN proposée par Pauling, qui avait placé les bases à l'extérieur pour que le code génétique de l'ADN soit accessible facilement. Cette structure est évidemment plus coûteuse en énergie que l'ADN-B car, d'une part, l'énergie d'appariement des bases est perdue mais surtout, les groupes phosphodiesters chargés positivement sont très proches l'un de l'autre. Or, Day et Liu ont trouvé il-y-a quelques années, qu'une phase d'ADN très similaire existe dans le virus Pf1. Pour ce virus, on pouvait penser que la structure de l'ADN était dictée par deux facteurs : les protéines d'enveloppes mais également le fait que cet ADN est une boucle simple brin incapable de former une double hélice. Les expériences réalisées au laboratoire montrent que cette phase est propre à l'ADN. Par ailleurs, les conditions requises pour l'apparition de l'ADN-P ne sont pas très difficile à remplir puisqu'il suffit d'un taux de surenroulement de s = +0.035 et d'une force de traction de 25 pN. Ce taux de surenroulement est important pour un micro-organisme mais néanmoins observable; en particulier on peut espérer atteindre cette contrainte en amont d'une ARN-polymérase dont on sait déjà qu'elle peut exercer une force de 14 à 30 pN sur l'ADN.

Il n'y a pas la possibilité de déterminer la structure cristallographique d'une molécule unique et on ne peut pas assurer que la phase adoptée corresponde exactement à celle calculée par ordinateur. Toutefois, le glyoxal a été utilisé pour vérifier que la nouvelle phase d'ADN-P présente également des bases non appareillées. Les résultats sont identiques à ceux obtenus dans le cas des bulles de dénaturation, la seule différence étant qu'il faut appliquer trois fois plus de tours dans le cas de l'ADN-P que dans celui de la dénaturation pour observer le même nombre de bases altérées. Ceci confirme le surenroulement de la phase ADN-P par rapport à l'ADN-B.

Références.

Stretched and overwound DNA form a Pauling-like structure with exposed bases J.-F. Allemand, D. Bensimon, R. Lavery, and V. Croquette. Proc. Nat. Acad. Sci. USA 95 (1998) 14152.

Phase coexistence in a single DNA molecule, T. R. Strick, J.-F. Allemand, D. Bensimon, R. Lavery and V. Croquette, Physica A 263 (1999) 392

Stress induced structural transitions in DNA and proteins, T. R. Strick, J.-F. Allemand, D. Bensimon and V. Croquette, to appear in Ann. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 29 (2000) 523

DNA mechanics and statistical mechanics, T. R. Strick, J.-F. Allemand, D. Bensimon and V. Croquette, Encyclopedia of Life Sciences (1999).

Enzymologie à l'échelle de la molécule unique :les topoisomérases.

D.Bensimon, V.Croquette,Allemand, T. Strick, G.Charvin, N. Dekker, collaborations N. Cozzarelli et N. Crisona de l'Université de Berkeley, et O. Hyrien à l'Ecole Normale, M. Duguet et P. Forterre de l'Université Paris Sud.

Dans la cellule, la molécule d'ADN d'un chromosome entier mesurerait une dizaine centimètres de long tandis qu'elle est empaquetée dans le noyau qui fait au plus dix microns de diamètre. Lorsque cette molécule est dupliquée ou lorsqu'elle est transcrite en ARN, la structure en double hélice conduit inévitablement à la formation d'enchevêtrements et de nœuds. Hors, il faut enlever ceux-ci lors de la séparation des chromosomes avant la mitose, sinon ils ne pourraient pas se séparer. Cette tâche ardue est réalisée par une famille d'enzymes les topoisomérases qui comme leur nom l'indique peuvent modifier la topologie de la molécule d'ADN. Trois types d'enzymes ont été étudiés :

La topoisomérase I se fixe de façon transitoire sur un brin de la double hélice, coupe la liaison covalente du lien phospho-diester, ce qui permet à la molécule de relâcher sa contrainte de torsion, puis reforme la liaison coupée avant de se détacher de la molécule d'ADN. La topoisomérase I réalise cette opération sans utiliser d'apport d'énergie externe.

La topoisomérase II se fixe au point de croisement de deux segments d'ADN double brins, elle coupe alors les deux brins d'un même segment et fait passer le second segment à travers la coupure tout en tenant les deux extrémités qu'elle recolle parfaitement après le passage du premier segment. Cette opération peu banale permet d'enlever les nœuds et de décaténer des molécules enchevêtrées. Elle nécessite la présence d'un cofacteur énergétique : l'ATP. La topoisomérase II est très importante au cours de la vie cellulaire, ses inhibiteurs sont fréquemment utilisés comme agents anticancéreux puisqu'ils conduisent à la mort des cellules qui se reproduisent beaucoup.

Le cycle de la topoisomérase IV ressemble à celui de la topoisomérase II mais alors qu'elle fonctionne très bien sur un surenroulement positif, elle est beaucoup moins efficace sur un sousenroulement négatif.

Les mécanismes moléculaires mis en jeu lors du cycle catalytique de la topoisomérase II sont loin d'être complètement compris. Les expériences permettant de les caractériser ne sont guère faciles. En tordant une molécule d'ADN grâce à une bille magnétique manipulée par des aimants, l'équipe du LPS a la possibilité de réaliser très rapidement et de façon contrôlée des torsades comme celle des cordons téléphoniques. C'est précisément sur ce type de configuration qu'agit la topoisomérase II. En ajoutant cette enzyme dans le liquide où baigne la molécule d'ADN torsadée, cette équipe a observé l'action catalytique de l'enzyme : celle-ci va faire passer un brin à travers l'autre jusqu'à supprimer complètement les torsades.

Expérimentalement, l'existence de torsades raccourcit la molécule soumise à une force de traction constante, l'action de l'enzyme conduit à un relâchement des torsades que l'on observe par l'allongement de la molécule. Chaque fois que l'enzyme réalise un passage de brins, elle enlève, en fait, deux tours de torsion à la molécule. L'équipe a réussi à observer un à un le passage de brins d'une seule topoisomérase II sur une molécule d'ADN. Dans les bonnes conditions, l'allongement de la molécule se fait par pas discret de 90 nm (voir figure).

Principe de l'expérience de relaxation d'une molécule surenroulée par une topoisomérase II . Relaxation de la longueur d'une molécule d'ADN torsadée lorsque l'ATP est à basse concentration. On observe une relaxation par pas correspondant à chaque cycle catalytique d'une seule enzyme.

Cette équipe a pu caractériser précisément le cycle catalytique de la topoisomérase II de la Drosophile et a ainsi mesuré les constantes cinétiques connues (Km, Vsat). En moyennant sur un grand nombre de réactions enzymatiques isolées, l'équipe a pu retrouvé une dynamique Michælis-Mentel typique d'une réaction enzymatique en solution. Cependant le dispositif offre des possibilités d'investigations nouvelles : il a été montré que le taux de relaxation topologique décroît avec la force de traction. Naïvement, on aurait pu s'attendre à un résultat opposé, le passage des brins étant plus favorable à haute force (le couple étant plus grand). Ce résultat surprenant peut s'expliquer si l'étape limitante de la réaction implique un mouvement de l'enzyme contre la force de traction (par exemple lors de la religation des brins de l'ADN).

En absence d'ATP dans le milieu expérimental, le fonctionnement de la topoisomérase II est contrarié. En fait, le cycle catalytique commence, l'enzyme s'accroche à un croisement d'ADN mais elle est alors incapable de continuer et se détache après quelques temps. Cette association entre l'enzyme et l'ADN est observable avec la méthode de mesure. Si la torsion de la molécule est ajustée juste au seuil d'apparition de la première torsade, on observe une succession d'associations et de dissociations enzyme/ADN, conduisant à l'apparition de sauts de longueur de la molécule de 45nm. on peut ainsi mesurer les temps d'association de la topoisomérase avec son substrat.

Pour la topoisomérase IV il a été montré qu'elle agissait de façon processive sur le sourenroulement tandis qu'elle devient distributive sur le sousenroulement.

La topoisomérase I agit sur la double hélice de l'ADN en se fixant sur l'un des brin de la double hélice qu'elle coupe de façon transitoire, ce qui permet à la molécule de relâcher sa torsion en tournant au tour du brin resté intact et finalement en refermant le brin coupé. Toute cette opération se fait sans co-facteur énergétique. Les topoisomérases I eucaryote relâchent aussi bien une torsion positive que négative ce qui les différencient de leurs homologues procaryote qui n'opèrent que sur des torsions négatives.

L'équipe du LPS a commencé l'étude de ces enzymes avec le même dispositif de micromanipulation. Les résultats préliminaires laissent penser que l'on peut déterminer le nombre de tours relâchés à chaque cycle enzymatique et espérer pouvoir décrire le mode de fixation de l'enzyme sur l'ADN. La difficulté que pose cet enzyme c'est le fait que son cycle ne dépende pas de l'ATP. Il a fallu trouver une autre façon de ralentir sa dynamique. Pour cela, une topoisomérase I provenant d'une bactérie thermophile vivant dans les sources chaudes à 70ºC, a été choisie. En la faisant travailler à 25ºC on peut nettement diminuer sa vitesse.

Références.

Single-molecule analysis of Topoisomerase II-DNA interactions, T. R. Strick, V. Croquette and D. Bensimon, Nature 404, (2000) 901

Study of DNA motors by single molecule micromanipulation, B. Maier, T. R. Strick, V. Croquette and D. Bensimon, Single Mol. 2 (2000) 145

Preferential relaxation of positively supercoiled DNA by Escherichia coli topoisomerase IV in single-molecule and ensemble measurements, N. J. Crisona, T. R. Strick, D. Bensimon, V. Croquette and N. R. Cozzarelli, Genes and Development 14 (2000) 2881

Twisting and stretching single DNA molecules, J.-F. Allemand, T. R. Strick, V. Croquette and D. Bensimon, Prog. Biophys. Molec. Biol 74 (2000). 115

Enzymologie : réplication d'une molécule d'ADN par une ADN-polymérase

D.Bensimon, V.Croquett, B. Maier.

La DNA polymérase qui recopie la molécule d'ADN transformant une molécule simple brin en une molécule double brin en associant à chacune des bases de la molécule simple brin les bases complémentaires a aussi fait l'objet d'une étude par la même technique. Cette enzyme est évidemment fondamentale puisqu'elle permet la réplication du patrimoine génétique. Elle agit un peu comme une locomotive se translatant sur une molécule qui avant son passage est sous forme simple brin et devient double brin après. De ce fait, elle se positionne à la jonction de ces deux types de structures.

Expérimentalement, le même dispositif que précédemment est utilisé, mais cette fois c'est une molécule d'ADN simple brin qui est placée entre la bille et la plaque de verre. Pour réaliser l'amorçage de la réaction, un petit morceau d'ADN simple brin complémentaire en un seul endroit de la molécule reliant la bille au substrat est ajouté à la solution. En s'hybridant ce morceau d'ADN forme une petite région d'ADN double brin qui va servir de point de démarrage pour la polymérase. Il suffit alors d'ajouter dans le milieu la polymérase et les bases de l'ADN pour que la synthèse puisse démarrer.

Dans cette expérience, encore une fois la longueur de la molécule va permettre de suivre l'avancement de la réaction : ceci est possible parce que l'ADN simple brin possède une courbe allongement/force très différente de celle de l'ADN double brin. En effet, à basse force l'ADN simple brin à tendance à réaliser des appariements fortuits entres bases conduisant à une molécule courte. Par contre à haute force, l'ADN simple brin peut s'allonger beaucoup plus que l'ADN double brin qui s'enroule en double hélice. A haute force la molécule simple brin est donc plus longue que la molécule double brin tandis que le comportement est inversé à basse force. Les deux courbes de force se croisent à une force de ª 4pN (voir figure). En appliquant une force constante sur la molécule, la mesure de sa longueur va dépendre de la proportion d'ADN simple brin et double brins. A basse force une molécule se transformant de simple brin à double brins sous l'action d'une polymérase s'allonge tandis qu'elle se raccourcit à haute force. La mesure de la longueur de la molécule en temps réel permet ainsi de suivre la progression de la DNA polymérase.

On observe ainsi que la synthèse du second brin se fait par à-coup avec de longues pauses. La vitesse de polymérisation dépend de la séquence répliquée, elle dépend également de la polymérase employée. Par ailleurs, en exerçant une force de traction sur l'ADN simple brin, dans un premier temps, on aide la polymérase, probablement en linéarisant l'ADN simple brin, puis lorsque la force de traction devient plus importante, la progression de l'enzyme est ralentie pour finalement s'arrêter à une force traction d'environ 20pN.

Références.

Study of DNA motors by single molecule micromanipulation, B. Maier, T. R. Strick, V. Croquette and D. Bensimon, Single Mol. 2 (2000) 145

Replication by a single DNA-polymerase of a stretched single strand DNA, B. Maier, D. Bensimon, V. Croquette, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 97 (2000) 12002

Courbes de forces d'un ADNss, ADNds et partiellement répliqué. Dans ce dernier cas, la courbe force extension correspond à la combinaison linéaire des courbes de force de l'ADN simple brin et double brin. Images en haut, comparaison d'un segment de 18 bases [AT]9 en simple brin et double brin. Le simple brin est complètement étendu, sa longueur est 2,1 fois plus grande que la molécule double brin.(Image R. Lavery IBPC)

Enzymologie à l'échelle de la molécule unique : hélicase dégrafant la double hélice.

M-N. Dessinges, D.Bensimon, V.Croquette, collaboration X. Xi (ENS Cachan)

La réplication de la molécule d'ADN nécessite d'abord la séparation des deux brins de la double hélice. Ce sont les hélicases qui réalisent cette opération au sein de la cellule. Ces enzymes s'insèrent dans la double hélice puis progressent le long d'un brin en cassant les liaisons hydrogènes liant les deux brins. Ces moteurs moléculaires font l'objet d'une intense activité visant à mieux comprendre leurs mécanismes. De fait, ces enzymes, ou plus précisément leur dysfonctionnement, sont impliqués dans de nombreuses maladies génétiques graves comme le syndrome de Werner conduisant à un vieillissement prématuré du patient.

Le fonctionnement des hélicases peut être vue comme le symétrique des polymérases dans la mesure où elles transforment de l'ADN double brins en simple brin. Cette équipe observe l'action des hélicases à haute force, leur action se traduisant par un allongement de la molécule au fur et à mesure que les brins de l'ADN sont séparés. Les mesures encore préliminaires permettent de déterminer leur vitesse et leur processivité. L'équipe espère pouvoir déterminer le pas élémentaire de cet enzyme..

Projets 

Fort de la compréhension des propriétés physiques de l'ADN, l'équipe autour de Bensimon/Croquette a donc commencé récemment l'étude biologiquement beaucoup plus pertinente des interactions ADN/protéines (topoisomérases et ADN-polymérases). Cette équipe va bien sur poursuivre ces études, tout d'abord in vitro avec le système de micro-manipulation décrit précédemment, mais ultimement in vivo. Cette équipe se prépare a ce cheminement vers une thématique encore plus biologique avec son implantation partielle dans un espace qu'elle a obtenu au Laboratoire de Biologie de l'ENS. Ci-suit une liste des thèmes nouveaux que cette équipe voudrait ainsi aborder.

 - Interaction entre sites de régulation. Ce projet, suivi principalement par J.-F. Allemand en collaboration avec A. Prochiantz et M. Volovitch du laboratoire de Biologie de l'ENS, concerne l'interaction entre sites de régulation sur l'ADN. Il s'agit ici de mesurer la force d'interaction entre une protéine régulatrice (engrailed) et son site de reconnaissance ainsi qu'étudier l'interaction entre deux sites de reconnaissance éloignés en fonction du degré d'enroulement de la molécule. Un système modèle a été conçu autour des sites de reconnaissance d'engrailed et GAL4 et d'une protéine chimérique fusionnant les domaines de reconnaissance de ces deux sites. Il n'y a aujourd'hui aucune donnée quantitative sur l'interaction entre sites de régulation éloignés (plusieurs kbps) en fonction du degré d'enroulement, qui devrait pourtant favoriser leur rapprochement. Les résultats attendus de cette expérience devrait apporter une réponse à cet aspect important de la régulation génétique. Par ailleurs le même système permettra de mesurer l'interaction entre la recombinase CRE et ses sites de fixation loxP, grâce au mutant que l'équipe a cloné et exprimé

- Dynamique d'une ARN-polymérase sous torsion. L'ARN-polymérase est une enzyme qui transcrit l'ADN en ARNm (messager). Dans la cellule le complexe ARN-polymérase/ADN est souvent fixe et c'est l'ADN qui se translate et s'entortille au fur et à mesure de la progression de la transcription. De fait l'ADN s'enroule positivement en aval du complexe et se déroule en amont. Pour relaxer ces contraintes de torsion très importantes la cellule utilise les topoisomérases mentionnées plus haut. L'étude de la dynamique d'une ARN-polymérase sous torsion est donc une continuation naturelle des travaux précédents sur les topoisomérases et les ADN-polymérases. Pour bloquer l'ARN polymérase sur son substrat l'équipe utilisera une protéine de fusion GAL4-T7-pol (gracieusement offerte par P. Drögge), qui s'ancre sur un site GAL4 et progresse à partir du promoteur de l'ARN-polymérase du phage T7 (même construction d'ADN que précédemment). Le système de manipulation de l'ADN permettra de suivre la progression de l'enzyme à travers l'entortillement de la molécule et d'étudier la vitesse de réplication en fonction de la tension et de la torsion appliquées sur l'ADN.

- Étude de la phase ADN-P in vitro et in vivo. Comme il a été dit, un ADN sur-enroulé peut présenter un phase inhabituelle où le squelette phosphate est au centre de la double hélice et les bases sont exposées en solution. Une question se pose immédiatement : cette structure existe-t-elle aussi in vivo? Pour essayer de répondre à cette question, l'équipe autour de Bensimon/Croquette a entrepris une collaboration avec L. Day, de l'Université. de New-York. Ce chercheur a en effet observé dans certains virus une structure très similaire, stabilisée dans ce cas par les protéines de l'enveloppe virale. Le but est de savoir si la structure est effectivement la même en utilisant les protéines du virus pour stabiliser la structure d'ADN-P créé dans les expériences précédentes. Si c'était le cas ces protéines seraient alors utiliser (ou leur produit de fusion avec la protéine fluorescente verte) pour éventuellement stabiliser (et identifier) l'existence d'une phase ADN-P dans la cellule in vivo (peut-être dans les régions activement transcrites). Des expériences préliminaires avec ces protéines virales n'ont rien donné de très probant. Il faudra sans doute jouer sur les paramètres physico-chimiques (pH, salinité, ions divalents) pour faciliter l'autoassemblage de ces peptides sur la structure ADN-P.

 - Visualisation/mesure de force sur une seule molécule. Jusqu'à présent e sont surtout des mesures de force sur l'ADN qui ont été effectuées. Cependant, il est apparu ces dernières années un ensemble de techniques impressionnantes de visualisation de molécules uniques, soit en fluorescence par onde évanescente, soit par microscopie confocale, soit par excitation à deux photons. Il parait naturel de vouloir coupler la technique de manipulation et mesure de force à une visualisation des molécules étudiées. Pour ce faire l'équipe a acquis un laser de puissance qui permettra, en collaboration avec L. Jullien du Laboratoire de Chimie de l'ENS, de développer une visualisation par excitation à deux photons dédiée à ce type d'études. Les possibilités sont très vastes. Dans un premier temps, la protéine fluorescente verte (GFP) sous tension sera étudiée. En collaboration avec M. Volovitch et A. Prochiantz, une GFP fonctionnalisée en ses extrémités a été obtenue de telle sorte qu'on puisse l'ancrer à une surface et tirer dessus avec une molécule d'ADN. La question est de savoir si l'excitation d'une GFP varie avec la force. Si c'était le cas on disposerait alors d'un dynamomètre moléculaire, d'autant plus intéressant que la GFP peut servir de marqueur fluorescent à de nombreuses protéines in vivo.

 - Étude d'une réaction enzymatique sous tension. Dans le même ordre d'idées que précédemment, lors d'une année sabbatique à l'Institut Weizmann de D. Bensimon, une collaboration avec Y. Stavans, a été initiée pour l'étude d'une enzyme sous traction. Le choix s'est porté sur la b- galactosidase, qui est une enzyme très bien connue depuis les travaux de Jacob et Monod et qui a l'avantage d'avoir plusieurs substrats dont le produit d'hydrolyse est fluorescent. En suivant la fluorescence du produit on a donc accès à l'activité de l'enzyme.En collaboration avec M. Volovitch et A. Prochiantz, l'équipe a modifié une b- gal pour l'ancrer à une surface et tirer dessus avec une molécule d'ADN. Lors du séjour de D. Bensimon à l'Institut Weizmann, un système de manipulation de l'ADN par pinces optiques a été monté associé à un système de détection de la fluorescence produite par une molécule de b- gal par illumination en onde évanescente et détection confocale. C'est une expérience sans doute faisable (l'équipe n'a pas (encore) rencontré de problème majeur), mais qui n'est pas facile. Le système de pinces optiques est aujourd'hui calibré et permet de mesurer l'élasticité d'une molécule d'ADN (ce qui est nécessaire pour savoir si l'on tire sur une seule enzyme). Le système de détection a la sensibilité voulue pour la détection d'une seule b-gal et il reste maintenant à intégrer le tout. C'est ce à quoi s'attellent Y. Stavans et son équipe.

 Ces deux derniers projets (GFP et b-gal) s'inscrivent dans une thématique plus large: la compréhension de la structure 3D des protéines. S'il est aujourd'hui impossible de prédire cette structure à partir de la séquence primaire des acides aminés, il est sans doute possible [R. Lavery, communication personnelle] d'étudier les déformations d'une protéine de structure connue soumise à une force déterminée. La réponse élastique d'une protéine pourrait ainsi renseigner sur l'existence (ou non) d'états métastables près de sa structure native.

 - Courbure intrinsèque de l'ADN eucaryote. Arnéodo et C. Thermes ont montré récemment que les génomes présentent des corrélations à longue portée, en particulier les génomes eucaryotes présentent des modulations de courbure destinées à l'accrochage des histones. De tels modulations doivent modifier leurs propriétés élastiques et l'équipe espère mettre en évidence ce changement dans ses expériences. Ce projet a reçu le soutien d'une ACI bioinformatique.

 - Mesure de la conductivité de l'ADN. La molécule d'ADN fait l'objet d'une controverse quant à ses propriétés électriques. Récemment le groupe d' H. Bouchiat à Orsay a pu montrer que l'ADN est un bon conducteur électrique dans lequel il est possible d'observer le passage d'un courant supraconducteur induit par des électrodes supraconductrices à très basse température. L'équipe du LPS se propose de combiner les techniques de micro-manipulation de molécules uniques aux mesures électriques des systèmes mésoscopiques pour déterminer la conduction électrique à l'échelle d'une seule molécule d'ADN. Cette étude est financée par une ACI nanostructure.

Matière molle et physique tournée vers le vivant : instrumentation.

E. Perez, C. Gourier, F. Pincet, L. Qian (postdoc), D. Tareste(thèse).

Durant les quatre dernières années, l'équipe Perez a construit plusieurs dispositifs permettant d'obtenir des informations complémentaires sur les interactions entre surfaces et entre molécules individuelles. Un grand axe concerne les molécules biologiques et l'adhésion cellulaire. Ces techniques sont aussi appliquées à d'autres problèmes, tels que friction, organisation bidimensionnelle, interactions colloïdales.

- Micromanipulation de vésicules : énergies d'adhésion. Cette technique consiste à maintenir deux vésicules lipidiques par une aspiration contrôlée à l'aide de deux micropipettes. Quand ces vésicules sont adhérentes, la mesure de l'angle de contact et de la tension des vésicules (déduite de l'aspiration) permettent d'obtenir directement l'énergie d'adhésion à l'aide de la relation d'Young-Dupré.

- Micromanipulation de cellules : forces d'adhésion. D'un point de vue expérimental, cette technique est similaire à la précédente. Cependant, contrairement aux vésicules, les cellules biologiques ne sont pas des objets élastiques et la mesure de l'angle de contact ne permet plus d'obtenir une énergie d'adhésion. En revanche, après avoir fait adhérer deux cellules maintenues par des micropipettes dans une chambre à 34°C (platine de microscope chauffante conçue au laboratoire), il est possible de mesurer la force nécessaire à les détacher l'une de l'autre. Le principe de la mesure est d'augmenter progressivement l'aspiration dans l'une des micropipettes jusqu'à déterminer l'aspiration critique à laquelle les deux cellules se séparent. Le diamètre des micropipettes étant connu, il est possible d'en déduire directement la force.  

- Capteur de forces à globule rouge. Cette technique, développée initialement par Evan Evans, consiste à utiliser un globule rouge comme ressort. Ce globule est maintenu à l'aide d'une micropipette. L'un des atouts de cette technique est que la raideur du ressort est modulable sur 5 ordres de grandeur par une simple variation de l'aspiration appliquée. Sur ce globule rouge est fixée une bille sur laquelle ont été greffés des ligands. Face à cette bille, comme indiqué sur la figure, une autre bille contenant les récepteurs complémentaires est maintenue à l'aide d'une autre micropipette. La pipette maintenant le globule effectue alors un mouvement de va et vient induit par un piézoélectrique permettant de mettre en contact les deux billes. La force s'exerçant entre les billes est obtenue par la mesure de la déformation du globule (logiciel de suivi de bille, développé au laboratoire par Vincent Croquette, et modifié pour l'adapter à cette technique). Les densités de ligands et récepteurs déposés sur les billes permettent la formation d'une liaison unique dans 10 pour-cent des contacts entre les billes.

La mesure de la force de rupture de la liaison en fonction du taux de charge (vitesse d'approche en pN/s) permet d'obtenir un panorama énergétique complet de la liaison. (soutien BQR ENS 1998)

Energies d'adhésion macroscopique, énergies de liaison unique, interactions entre membranes

E. Perez, C. Gourier, F. Pincet, L. Qian, D. Tareste, J. Vannimenus, collaborations L. Lebeau et C. Mioskowski (Laboratoire de Synthèse Bio-Organique, Illkirch), Evan Evans, (UBC, Vancouver, Canada), Sophie Cribier (IBPC, Paris), M. Goldmann (LURE), P. Sinay, ( Département de Chimie, ENS), J.P. Thiery (Biologie, Institut Curie), C. Branlant (Biologie, Nancy), P. Bassereau (Physico-Chimie Curie).

Les milieux biologiques font intervenir des molécules qui s'assemblent et se désassemblent en permanence selon les signaux qu'elles reçoivent et avec leur dynamique propre. Dans ce contexte, l'équipe d'Eric Perez s'intéresse à l'adhésion entre vésicules fonctionnalisées et entre cellules biologiques ainsi qu'aux interactions récepteur-ligand. Les lipides sont synthétisés par des chimistes et les cellules et récepteurs sont produits par des biologistes avec lesquels il existe une collaboration étroite. Les mesures d'énergies d'adhésion macroscopique et d'énergies de liaison unique ont en particulier fait l'objet d'une étude approfondie. Plusieurs systèmes ont ainsi été étudiés allant de la simple liaison hydrogène à l'interaction plus complexe ARN-protéine en passant par les interactions de chélation.

- Physique statistique de l'énergie d'adhésion par sites et relation à l'énergie de liaison collaboration avec J. Vannimenus. L'adhésion de surfaces sur lesquelles diffusent des sites d'accrochage est un problème qui n'a été jusqu'à présent modélisé que par des approches utilisant les potentiels chimiques des composants. Ces modèles ne permettaient pas de trouver une relation entre les propriétés d'une liaison unique (énergie de liaison) et l'énergie d'adhésion macroscopique. Une approche microcanonique simple a permis de retrouver les prédictions de ces modèles et de relier l'observable macroscopique (énergie d'adhésion globale) à l'énergie d'une liaison unique. Ce modèle a été validé par des mesures avec des bases de l'ADN et utilisé sur deux autres systèmes originaux : des glycolipides et des molécules interagissant par chélation.

- Mesure des interactions entre bases de l'ADN : l'adénosine et la thymidine. Ce travail a été réalisé en collaboration avec L. Lebeau. Parce qu'elles forment des liaisons faibles (liaison hydrogène et stacking) avec un temps de vie limité, les bases de l'ADN peuvent créer de l'adhésion réversible et donc mesurable. Elles constituent de bons modèles pour explorer la dynamique d'assemblages biologiques A l'aide d'un appareil à forces entre surfaces, l'équipe avait déjà caractérisé les interactions entre bicouches formées de lipides fonctionnalisés avec l'adénosine (A) ou la thymidine (T). Cette étude avait en particulier permis de mesurer les énergies de liaison impliquées. Au cours des 4 dernières années, deux nouvelles méthodes ont permis de retrouver ces énergies. Cet éventail d'approches disponibles pour mesurer des énergies de liaison permet maintenant de s'intéresser à un grand nombre de liaisons intermoléculaires. Par ailleurs, les couches fonctionnalisées par ces lipides présentent des propriétés physico-chimiques inhabituelles : transition de phase ressemblant à l'hémifusion de membranes cellulaires et formation de domaines polarisés géants.

- Nanotitration de liaisons faibles : réalisée en collaboration E. Evans, (Canada). L'énergie de liaison spécifique de l'adénosine et la thymidine a pu être quantifiée par une autre technique. Celle-ci consiste à contrebalancer l'attraction A-T par un potentiel répulsif ajustable : une force électrostatique double-couche. Deux vésicules chargées et fonctionnalisées par des lipides contenant soit A soit T dans leur tête polaire sont micromanipulées. Leur adhérence est testée en jouant, soit sur la composition de la vésicule en lipides chargés, soit sur l'écrantage. L'énergie électrostatique critique à laquelle l'adhérence disparaît est alors égale exactement à l'énergie de liaison des molécules.

Les mesures ont été effectuées sur le couple A-T et le couple A-A (qui présente aussi une forte affinité). Cette technique permet de retrouver les résultats déjà obtenus avec l'appareil à forces entre surfaces. Par ailleurs, en jouant sur certains paramètres physico-chimiques, il a été possible de montrer que la portée de l'interaction A-T ne dépasse pas quelques nanomètres.

- Vérification expérimentale de la théorie de l'adhésion avec sites mobiles : L'énergie de liaison de l'adénosine et de la thymidine étant bien connue, ces molécules sont apparues comme des candidates idéales pour la validation du modèle d'adhésion par sites (modèle décrit plus haut). L'équipe a ainsi pu étudier l'adhésion d'une vésicule sur une bille, toutes deux fonctionnalisées par ces bases. Le modèle microcanonique a effectivement permis de retrouver les énergies de liaison en jeu. Outre la validation du modèle, cette étude présente une nouvelle méthode pour mesurer les énergies de liaison.

- La fusion membranaire induite par des interactions spécifiques a été étudiée en collaboration avec Sophie Cribier (IBPC, Paris) et a bénéficié d'un Contrat PCV en 1999. En présence de sel (quelques mM), des vésicules de lipides neutres simples (par exemple la DOPC) adhèrent grâce à l'attraction de van der Waals. L'équipe a écrit un programme numérique permettant d'estimer assez précisément la distance des deux vésicules à l'équilibre. Ce programme est largement inspiré de résultats d'E. Evans publiés en 1991. Les résultats obtenus (3 nm pour deux vésicules de DOPC) sont en accord avec les résultats donnés dans la littérature pour des phases lamellaires de DOPC.

A l'équilibre, la zone de contact de deux vésicules adhérentes s'apparente donc localement à deux bicouches d'une phase lamellaire. Des lipides fonctionnalisés par deux bases de l'ADN ont été insérés dans des vésicules de DOPC afin de réduire la distance d'équilibre jusqu'à environ 1 nm (estimation numérique). A une telle distance, les diagrammes de phase de la DOPC indiquent que la phase en bicouches n'est plus stable. Des expériences de fluorescence ont montré qu'une transition a effectivement lieu et qu'il s'agit sans doute d'une phase de micelles inverses.

Ce résultat est à rapprocher d'une des étape de la fusion membranaire : l'hémifusion. En effet, l'action de certaines protéines fusogènes consiste à rapprocher les membranes cellulaires comme le font les lipides fonctionnalisés dans ce système modèle. A terme, il sera peut-être possible de comprendre sur des systèmes extrêmement simples le processus de fusion membranaire.

- Monocouches à têtes associatives et à chaînes désordonnées : en collaboration avec M. Goldmann, LURE. Une monocouche lipidique à l'interface eau-air dont l'isotherme de compression indique une forte compressibilité est automatiquement assimilée à une couche désordonnée (état liquide-expansé). Les lipides A et T contredisent cette règle. En effet, les mesures d'interactions entre bicouches fonctionnalisées avec les bases de l'ADN présentent une attraction à grandes distances. Une origine possible serait la formation de domaines polarisés dont la taille serait de l'ordre de grandeur de la portée de l'attraction. Les bases de l'ADN ayant une tendance à mettre leurs plans parallèles, de tels domaines sont envisageables bien que l'isotherme de compression des lipides indique un état liquide-expansé. Afin d'en vérifier l'existence, la diffraction de rayons X en incidence rasante a été entreprise au LURE. Les résultats indiquent qu'un ordre bidimensionnel est induit par les bases de l'ADN. Une monocouche ayant un isotherme du type liquide-expansé n'est donc pas obligatoirement désordonnée. D'un point de vue des mesures d'interaction entre surfaces, ce résultat apporte une validation expérimentale de l'origine possible d'attractions à grandes distances. Enfin, expérimentalement, il est extrêmement difficile d'obtenir une information sur l'ordre des têtes polaires quand les chaînes aliphatiques sont désordonnées car la section efficace des têtes polaires est très faible.

- Une nouvelle classe d'interaction biologique : l'interaction sucre-sucre en collaboration avec P. Sinay, Chimie, ENS. Cette étude a fait l'objet d'un contrat avec l'Oréal et d'un contrat PCV 1998.

Les interactions impliquant les sucres sont connues en biologie sous le label "interaction protéine-sucre", tandis que l'interaction "sucre-sucre" est rarement évoquée par les biologistes. Une équipe de biochimistes a récemment fait l'hypothèse pour expliquer ses résultats qu'un sucre, le déterminant Lewis X, interagit spécifiquement avec lui-même en présence de calcium et joue un rôle central en générant de l'adhésion dans l'étape de compaction de l'embryon. Les chimistes du département de Chimie de l'ENS ont synthétisé des lipides dont la tête polaire est le Lewis X. Des premières expériences faites avec l'appareil à forces entre surfaces n'ont pas permis de mettre en évidence cette interaction. En faisant des expériences avec ces molécules par la technique de vésicules micromanipulées, il a été possible de montrer que cette reconnaissance moléculaire existe, que, comme cela était soupçonné, elle n'a lieu qu'en présence de calcium et que l'énergie de liaison est inférieure à kBT. Il est apparu a posteriori que la valeur de l'énergie de liaison combinée à la concentration en calcium nécessaire à la formation des complexes entraîne une adhésion trop faible par rapport à la précision de l'appareil de forces entre surfaces.

Le Lewis X est lié au lipide par l'intermédiaire d'un espaceur flexible. Les mesures d'interactions entre bicouches de lipides Lewis X ont permis de mettre aussi en évidence des interactions non spécifiques, les répulsions à courte portée induites par l'espaceur. Les résultats correspondent bien aux prédictions de la théorie d'Alexander &emdash; de Gennes pour les brosses de polymères. Par ailleurs, afin d'établir des contrôles rigoureux de l'adhésion mesurée entre vésicules, les mêmes chimistes ont synthétisé différents lipides présentant plusieurs longueur d'espaceurs. Les énergies d'adhésion en résultant mettent en évidence la baisse d'adhésion quand la longueur de l'espaceur augmente.

- Liaisons de chélation : Nickel -NTA, étude en collaboration avec C. Mioskowski, Laboratoire de Synthèse Bio-Organique, Illkirch.(contrat PCV 2000)

Afin de fixer des protéines sur des substrats, on utilise fréquemment un Légo moléculaire composé d'un motif nitrilotriacétate (NTA) complexé par un atome de nickel lui-même capable de fixer des protéines contenant une polyhistidine. L'interaction nickel &emdash; NTA est, malgré son utilisation intensive, très mal caractérisée.

Des mesures d'interaction ont été effectuées à l'aide de l'appareil à force entre surfaces et de la technique des vésicules micromanipulées. Ces expériences ont mis en évidence qu'un atome de nickel peut être partagé par deux groupements NTA; les énergies de liaison impliquées sont de l'ordre de kBT.

- Dynamique de l'adhésion de cellules exprimant des cadhérines en collaboration avec J.P. Thiery, Institut Curie. Cette étude a bénéficiée d'un contrat Institut Curie 1997-2000. Les cadhérines sont des protéines qui sont responsables de la cohésion des tissus. Il en existe une très grande variété dont l'expression varie d'un individu à l'autre. Or, certains cancers peuvent provenir de ce que les cadhérines n'ont pas toutes les mêmes propriétés adhésives. Il paraît utile de quantifier l'action de chaque cadhérine pour pouvoir les comparer entre elles et étudier la dynamique d'adhésion. Pour cela, l'équipe mesure la force d'adhérence de deux cellules cancéreuses de souris exprimant un seul type de cadhérine en fonction du temps d'adhérence. Quatre types de cadhérines ont été étudiés et comparés. Les résultats sont parfaitement cohérents avec les vitesses d'agrégation obtenues par les biologistes et ont permis de quantifier l'efficacité relative de chacune des cadhérines. Les prochaines étapes consisteront à travailler sur des cadhérines chimériques contenant des domaines issus de deux types différents de cadhérines. Il sera ainsi possible d'étudier le rôle de chaque partie de la molécule. Puis, l'organisation bidimensionnelle des protéines dans la zone de contact sera observée par fluorescence. Enfin, la dynamique de déclenchement de l'adhésion sera étudiée en utilisant différents stimuli.

- Mesure de forces sur liaisons uniques entre un ARN et une protéine: REV - RRE en collaboration avec C. Branlant, Biologiste, Nancy. Cette étude a fait l'objet d'un contrat Nano-objet individuel 1999. Lorsqu'un ARN du virus HIV est dupliqué dans le noyau d'une cellule il doit, pour en sortir et constituer un nouveau virion, s'associer à la protéine REV. Ceci représente donc une voie possible pour bloquer l'infection et cette interaction mérite d'être maîtrisée. Dans ce contexte, les forces de rupture de liaisons uniques entre une protéine (REV) et un fragment d'ARN (partie RRE qui s'associe à la REV) du HIV ont été étudiées au moyen du capteur de forces à globule rouge. La comparaison des premiers résultats avec ceux obtenus pour un fragment d'ARN témoin met clairement en évidence la forte affinité REV-RRE. Dans les prochains mois, le panorama énergétique de la liaison devrait être complètement décrit.

- Charges non-contrôlées dans les bicouches lipidiques. L'équipe a pu, par des mesures précises des interactions entre des bicouches de lipide supposé neutre et par des expériences d'électrophorèse dans différentes conditions physico-chimiques, mettre en évidence l'existence d'une charge résiduelle toujours présente et indétectable par les techniques chromatographiques habituelles. Ces charges, dues à des impuretés permettent d'expliquer les résultats inattendus de plusieurs groupes en France et dans le monde.

Trous dans les bicouches lipidiques : Nombre d'expériences font intervenir des bicouches de lipides déposées sur une surface solide. Il est récemment apparu que, contrairement à ce qui était admis, ces bicouches ne sont pas parfaitement lisses et uniformes, mais qu'elles sont parsemées de trous. L'origine de ces trous n'était pas comprise, mais il est clair qu'ils peuvent avoir une influence sur les propriétés des couches. En collaboration avec P. Bassereau, cette équipe du LPS a montré qu'ils sont dus à l'équilibre, au niveau de la ligne triple mica/eau/air, entre les lipides à l'interface eau/air et les lipides sur le solide. Cette étude a montré que de simples mesures de rapports de prélèvement permettent d'obtenir l'énergie d'adsorption du lipide sur le substrat.

Références

Electrostatic nanotitration of weak biochemical bonds, F. Pincet, W. Rawicz, E. Perez, L. Lebeau, C. Mioskowski and E. Evans Phys. Rev. Lett. 79 (1997) 1949-1952

Quantitative analysis of holes in supported bilayers providing the adsorption energy of surfactants on solid substrate, P. Bassereau, F. Pincet, Langmuir 13 (1997) 7003-7007.

Translational order in Liquid-expanded lipid monolayers functionalized with nucleosides, E. Perez, F. Pincet, M. Goldmann, L. Lebeau and C. Mioskowski, The Eur. Phys. J. B 6 (1998) 1-4.

Bilayers of neutral lipids bear a small but significant charge, F. Pincet, S. Cribier, E. Perez, The Eur. Phys. J. B 11 (1999) 127-130.

Monolayer organisation modeling using molecular dynamics S. Rovillard, E. Perez, R. Ionov, M. Voue, J. de Coninck, Langmuir , 15, 2749-2754 (1999)

Ultraweak sugar-sugar interactions for transcient cell adhesion, F. Pincet, T. Le Bouar, Y. Zhang, J. Esnault, J.M. Mallet, E. Perez, P. Sinay Biophys. J. 80 (2001) 1354-1358

New highly hydrophobic lewis x glycolipids: synthesis and monolayer behaviour, J. Esnault, JM. Mallet, Y. Zhang, P. Sinay, T. Le Bouar, F. Pincet, E. Perez Eur. J. of Organic Chem. 2001 (2001) 253-260

Short-range specific forces are able to induce hemifusion, F. Pincet, L. Lebeau, S. Cribier, Eur. Biophys. J. 30 (2001) 91-97

Tetrahedral onsager crosses for solibility improvement and crystallisation bypass. I. Aujard, JP. Baltaze, JB. Baudin, E. Cogné, F. Ferrage, L. Jullien, E. Perez, V. Prévot, L. Qian, O. Ruel J.A.C.S. (accepté juin 2001)

Hydratation et repliement de protéines en solutions aqueuses et dans des micelles inverses.

W. Urbach,Valdez, collaboration J-Y Le Huérou (LIP, Université Paris VI)

Les protéines sont formées d'un assemblage d'acides aminés et acquièrent leur structure tridimensionnelle lors d'un mécanisme de repliement. Leur forme est l'élément clé de leur action. Suivant le repliement, une protéine peut avoir un rôle bénéfique ou produire des effets dévastateurs. De même un médicament à base de protéine sera efficace ou non selon la forme qui aura été donnée aux molécules. La découverte qu'une protéine "mal" repliée puisse devenir un agent pathologique, en l'absence d'un pathogène vivant, a ouvert la porte à la notion des "maladies du repliement" dont la liste s'allonge. On en compte au moins une vingtaine actuellement, les plus célèbres étant les maladies à prions, à l'origine de la maladie de la "vache folle" et de la maladie de Creutzfeld Jacob, mais aussi la fibrose cystique, la maladie de Parkinson, la maladie d'Alzheimer. Aujourd'hui, beaucoup de molécules biologiques (peptides, protéines) sont obtenues par génie génétique. L'expression de protéines humaines à but thérapeutique par des bactéries, a souvent pour conséquence un repliement incomplet. Il s'en suit, comme on s'en est récemment aperçu pour l'interféron bêta (unique traitement de la maladie d'Alzheimer), que ces protéines partiellement repliées, exposent des sites antigéniques dissimulés dans la molécule native, induisant chez l'homme des anticorps qui neutralisent la molécule. Il est donc extrêmement important d'avoir une technique susceptible de mettre en évidence de tels défauts de repliement.

Le volume partiel spécifique et la compressibilité adiabatique d'une protéine sont des grandeurs macroscopiques observables, sensibles aux changements de structure, à la dynamique, aux propriétés conformationnelles des macromolécules dans un solvant donné, donc à leur hydratation. Ces propriétés rendent compte d'événements se produisant lors du repliement des protéines et susceptibles de modifier l'intérieur de ces macromolécules.

L'équipe a étudié, en fonction du taux d'hydratation, les variations de la compressibilité et de volume spécifique de protéines confinées dans des micelles inverses d'AOT dont les dimensions sont voisines de celles des protéines. L'utilisation de ce système micellaire, proche du milieu natif, et dont la quantité d'eau est parfaitement contrôlée, permet l'étude de la conformation et des propriétés physico-chimiques des protéines dans des conditions expérimentales nettement plus satisfaisantes que des solutions aqueuses de détergents ou des mélanges de solvants habituellement utilisés.

 Le choix s'est porté sur des protéines dont les structures ont été déterminées, que ce soit dans l'eau ou, dans les micelles, par d'autres techniques (dichroïsme circulaire, spectre de fluorescence). Parmi les protéines retenues, il y a 3 protéines basiques, et une protéine légèrement acide. Dans les micelles inverses d'AOT, les têtes polaires des molécules d'AOT portent des charges électriques négatives. Les protéines basiques sont chargées positivement, et sont attirées fortement par les têtes polaires d'AOT. Ce n'est pas le cas pour la protéine non basique. Deux des trois protéines basiques sont globulaires, chargées positivement à l'extérieur. L'autre protéine est une protéine membranaire.

L'équipe a mesuré les masses volumiques (r) et la vitesse ultrasonore (c) et en déduit la compressibilité ( =1/rc2) des solutions contenant 3 protéines basiques : cytochrome c, lysozyme et MBP (protéine basique de la myéline) en solution aqueuse et dans des micelles inverses. Ces résultats sont comparés avec ceux obtenus avec la protéine non-basique, la b-lactoglobuline.

Lorsque le rayon des micelles est inférieur à 30 Å, la majorité des molécules d'eau est liée aux têtes polaires du surfactant et les protéines sont hydratées au minimum. Quelle que soit la taille des protéines, et quelle que soit leur charge, pour des faibles taux d'hydratation, la compressibilité est maximale et du même ordre de grandeur : 37 (± 2) 10-11 Pa-1. Cette valeur est aussi du même ordre de grandeur que les valeurs des compressibilités intrinsèques calculées théoriquement et correspondant à la compressibilité des protéines en l'absence d'eau. Cette valeur n'avait jamais pu être mesuré auparavant. Il s'agit donc d'un résultat original.

La compressibilité de la b-lactoglobuline dépend uniquement de l'hydratation, aucun changement de structure n'est observé.

La compressibilité de la MBP est complètement différente dans l'eau (protéine dépliée mais non dénaturée) et dans les micelles où la protéine est repliée. Pour la MBP (protéine basique de la myéline) la compressibilité dans les micelles est constante quelle que soit l'hydratation (aucun changement de structure n'est observé, la protéine est repliée et le reste en contact avec la membrane).

Pour les 2 autres protéines basiques étudiées, la compressibilité dépend de l'hydratation sans jamais atteindre la valeur pour la protéine dépliée dans l'eau. Elle dépend de la structure tridimensionnelle de la protéine et de l'hydratation.

Projet.

Etude du changements de structure de la b-lactoglobuline en solution aqueuse. Parmi les protéines d'accès commercial facile, la b-lactoglobuline, dont la structure cristalline a été déterminée aux rayons X avec une résolution de 1,8 Å, constitue un bon sujet d'étude pour suivre expérimentalement la transition de la forme dite en feuillets repliés b vers une forme en hélice a non native. Malgré de nombreux travaux de ces dernières années, le mécanisme exact de cette transition conformationnelle, qui se produit en présence d'alcool (2-propanol) ajouté en quantités croissantes à une solution aqueuse, n'est pas éclairci. Les mesures volumétriques contribueront à éclairer ce problème. Ce mécanisme semble être comparable de celui qui existe dans le prion et du peptide Ab d'Alzheimer.

Nous voulons vérifier si ces transformations s'accompagnent également de modifications de compressibilité de la solution étudiée.

Génétique évolutive.

 J. Ninio

Un travail théorique, entamé en 1991, sur les liens entre les divers niveaux de variabilité génétique et non-génétique, et les voies diverses par lesquelles se produisent les mutations (avec, notamment, le concept devenu classique de "mutateur transitoire"), a été poursuivi. D'une part, les analyses qui avaient été faites sur les bactéries ont été étendues aux organismes supérieurs, faisant apparaître des inconsistances dans le jeu des paramètres couramment admis. D'autre part, il a été proposé que certaines mutations prennent naissance lors de réparations fautives effectuées sur des segments d'ADN sains, mais présentant des "défauts illusoires". Ces structures postulées pourraient être mises à profit dans les mécanismes d'hypervariabilité génétique.

Références

The evolutionary design of error-rates and the fast fixation enigma. Ninio, J. Origins of Life and Evolution of the Biosphere 27 (1997) 609.

Illusory defects and mismatches - why must DNA repair always be (slightly) error-prone ? Ninio, J., BioEssays 22 (2000) 396.

Réseaux génomiques.

J-P Nadal et G Weisbuch, V. Hakim, K Willbrand, collaboration le Dépt. de Biologie de ENS et l'Institut Curie

 Début d'une collaboration en "bioinformatique" sur l'analyse des données issues des "puces à ADN". Celles-ci permettent d'obtenir des transcriptomes, c'est à dire l'ensemble des gènes actifs dans des cellules. L'objectif de l'équipe est de caractériser le réseau d'interaction génomique à partir des observations.

Oscillations dans les réseaux de neurones.

V. Hakim, N. Brunel, collaborations Marie-Line Chabanol, Wouter-Jan Rappel, D. Amit (Rome & Jérusalem)

Dans un premier temps, V. Hakim et Wouter-Jan Rappel, ont étudié une version globalement couplée de l'équation de Ginzburg-Landau complexe et montré l'existence de régimes très variés suivant les paramètres choisis . Ils ont, en particulier, mis en évidence l'existence d'une phase où le mouvement collectif est chaotique. Un des aspects surprenants de cette phase est que l'ajout d'un faible bruit suffit à régulariser le système et à rendre périodique le comportement de la variable collective. En collaboration avec Marie-Line Chabanol, ils ont développé une analyse de champ moyen décrivant les caractéristiques principales du mouvement collectif non-trivial (amplitude, fréquence dominante,...). Le calcul nécessite l'obtention des poids relatifs de différents attracteurs en présence d'un faible bruit, (cycle limite et point fixe) analogues des poids de Boltzmann pour un système déterministe qui ne dérive pas d'une énergie, ce qui est déjà un problème intéressant en soi.

Ces résultats ont conduit V. Hakim à s'intéresser à l'apparition d'une dynamique collective dans un autre contexte. Dans de nombreux enregistrements électrophysiologiques, les neurones individuels émettent des potentiels d'action à un taux relativement bas (1-5 Hz) tandis qu'une oscillation collective rapide (40-200 Hz) est observée dans des enregistrements plus globaux. En collaboration avec N. Brunel, il a proposé une description de ce phénomène en simplifiant et en analysant des modèles développés antérieurement par lui-même et D. Amit dans un autre but. En particulier, ils ont montré que la fréquence rapide d'oscillation est liée à la durée des courants synaptiques et que l'oscillation collective rapide n'apparaît qu'au-dessus d'un seuil bien défini, via une bifurcation de Hopf. Ces résultats semblent correspondre, au moins qualitativement à des observations électro-physiologiques récentes sur des tranches d'hippocampe de rat [Fisahn et al, Nature 394 (1998) 186]

Ensuite, des modèles plus réalistes de bruit synaptique, en situation stationnaire (Brunel & Sergi 1998) ou non (Brunel et al 2001) ont été considérés. L'un des principaux résultats est d'avoir démontré analytiquement que la présence d'un bruit synaptique prenant en compte la décroissance des courants post-synaptiques permet à la probabilité de décharge de suivre instantanément un courant modulé à une fréquence arbitrairement grande, contrairement au cas du bruit blanc. Les effets d'un bruit synaptique provenant de l'activation simultanée de plusieurs types de récepteurs avec des cinétiques différentes sont actuellement étudiés (Fourcaud & Brunel, en préparation)

Références :

Collective chaos and noise in the globally coupled complex Ginzburg-Landau equation, M.-L. Chabanol, V Hakim et W.-J. Rappel, Physica D 103 (1997) 273-293

Analysis of a dissipative model of self-organized criticality with random neighbors, M.-L. Chabanol et V Hakim, Phys. Rev. E56 (1997) R2343-2347

Asymptotic techniques in nonlinear problems: some illustrative examples, V. Hakim pp 295-386 in Hydrodynamics and Nonlinear Instabilities, édité par C. Godrèche et P. Manneville (Cambridge U. Press, 1998)

Fast global oscillations in networks of integrate-and-fire neurons with low firing rates, N Brunel et V Hakim, Neural Computation 11 (1999) 1621-1671

 Effects of synaptic noise and filtering on the frequency response of spiking neurons N. Brunel, F. Chance, N. Fourcaud, and L. Abbott. Phys. Rev. Lett., 2001, sous presse..

 Firing frequency of integrate-and-fire neurons with finite synaptic time constants,.N. Brunel and S. Sergi, J. Theor. Biol. 195 (1998) 87

 Model of global spontaneous activity and local structured activity during delay periods in the cerebral cortex, D. J. Amit and N. Brunel, Cerebral Cortex, 7 (1997) 237.

 Dynamics of sparsely connected networks of excitatory and inhibitory spiking neurons.N. Brunel,. J. Comput. Neurosci., 8 (2000) 183.

Projets.

V. Hakim compte poursuivre l'analyse des oscillations dans les systèmes de neurones couplés. En particulier, l'étude de modèles plus détaillés et plus réalistes devrait permettre de comparer plus précisément les résultats aux expériences et de préciser dans quelle mesure le mécanisme simple dégagé précédemment rend compte des observations. Il espère aussi clarifier les rôles respectifs joués par les propriétés intrinsèques des neurones individuels et par leurs interactions dans la dynamique collective résultante. A plus long terme, un des objectifs est d'aider à dégager la signification réelle et le rôle de ces oscillations collectives rapides, une question majeure actuellement sans réponse mais dont de belles expériences sur le lobe antennaire (bulbe olfactif des insectes) [M. Stopfer et al, Nature 390 (1997) 70] laissent espérer l'élucidation. Sur ce thème de recherche, il a obtenu le soutien de l'Union Européenne par l'attribution d'un bourse post-doctorale de deux ans à Magnus Richardson (programme "Improving Human Research Potential").

Activité persistante et mémoire à court terme.

N. Brunel, collaboration D.Amit (Rome & Jérusalem), A. Compte et X.-J. Wang (Brandeis), P. S Goldman-Rakic (Yale)

Cette équipe s'est interessée aux mécanismes conduisant à une activité persistante dans les réseaux neuronaux et la mémoire à court terme (mémoire de travail). Les mécanismes permettant à l'excitation récurrente de maintenir des états collectifs d'activité persistante en coexistence avec l'état d'activité spontanée ont été étudiés. Ces travaux sont motivés par des enregistrement de cellules dans le cortex préfrontal (Funahashi et al 1989), inférotemporal (Miyashita 1988), et pariétal postérieur (Chafee and Goldman-Rakic 1998) du singe éveillé durant des tâches de mémoire à court terme. La mémoire d'objets a été d'abord considérée (Amit & Brunel 1997, voir ci dessus), puis la mémoire spatiale à court terme (Compte et al., 2000), en collaboration avec X. J. Wang et P. S. Goldman-Rakic. Les modèles utilisés dans ce second cas présentent une architecture columnaire, assez analogue à celle des cortex sensoriels. On observe trois types de régimes, en fonction de la force de l'excitation récurrente entre des neurones sélectifs pour le même objet ou position: (i) si l'excitation récurrente est en dessous d'un premier seuil, seul l'état d'activité spontanée est stable, et le réseau n'a pas de propriété de mémoire. (ii) dans un régime intermédiaire, on observe une coexistence entre état d'activité spontanée (atteint après une stimulation non sélective) et des états d'activité persistente (atteints après stimulation d'une partie des neurones sélectifs correspondants). (iii) Au delà d'un deuxième seuil de l'excitation récurrente, l'activité spontanée devient instable. Les liens entre les niveaux d'activité persistante et d'activité spontanée dans le réseau et la courbe de réponse f-I des cellules pyramidales ont été analysés (Brunel 2000, voir ci dessus). Enfin, la résistance d'objets en mémoire à court terme à des distracteurs, ainsi que différents scénarios de neuromodulation par la dopamine, ont été étudiés (Brunel & Wang, soumis). L'étude de ces modèles permet de comprendre par quels mécanismes, en particulier ceux affectant l'équilibre entre excitation et inhibition, la dopamine pourrait affecter le niveau de l'activité persistante et donc les capacités de mémoire de travail.

Référence 

Synaptic mechanisms and network dynamics underlying spatial working memory in a cortical network model, A. Compte, N. Brunel, P. S. Goldman-Rakic, and X.-J. Wang, Cerebral Cortex 10 (2000) 910.

Cellules de lieu hippocampiques

N. Brunel, collaboration O. Trullier (Collège de France)

Un modèle de plasticité de la sélectivité des cellules de lieu directionnelles dans l'hippocampe a été étudié en collaboration avec Olivier Trullier, étudiant dans l'équipe de Sidney Wiener (LPPA, Collège de France). Il explique par des mécanismes de plasticité synaptique des connections récurrentes de l'aire CA3 (Brunel & Trullier 1998) les résultats expérimentaux sur la directionnalité des cellules de lieu (voir Markus et al 1995) obtenus chez le rat in vivo. Dans le modèle, les cellules de lieu recoivent des entrées externes faiblement directionnelles. Quand le rat effectue des trajectoires qui couvrent uniformément un environnement ouvert, les cellules tendent à perdre leur directionnalité, à cause du renforcement des connections excitatrices reliant des neurones sélectifs pour des directions voisines dans la même position. Par contre, dans le cas de trajectoires répétées le long de routes bien définies, ces cellules gardent et amplifient leur directionnalité, car les neurones sélectifs pour deux directions opposées n'ont jamais un taux de décharge élevé au même moment. Le modèle permet d'expliquer comment, dans le cas d'un environnement ouvert, les cellules peuvent regagner leur directionnalité après un changement de la tâche du rat, dans le cas où il passe de l'exploration aléatoire à des trajectoires le long de routes, comme cela a été observé dans les expériences de Markus et al (1995).

Codage par population.

N. Brunel et J.-P. Nadal

Dans le contexte de l'étude du "codage par population" (un grand nombre de cellules codent pour un stimulus, e.g., une direction dans l'espace), cette équipe a montré l'importance d'un lien entre une quantité d'information au sens de Shannon, caractérisant la qualité du codage, et l'information de Fisher, qui caractérise la précision optimale dans l'estimation de la valeur du stimulus à partir des activités des neurones. Ce lien entre théorie de l'information d'une part et théorie de l'estimation d'autre part n'était connu que depuis peu (Barron and Clark 1990, Rissanen 1996) ; cette équipe en a donné une dérivation simple, qui découle de manière naturelle de l'étude du codage par population. Ce résultat a été illustré sur des données concernant le codage de l'orientation de la tête chez le rat.

Référence

Brunel N. and Nadal J.-P., Mutual information, Fisher information and population coding Neural Computation, Vol. 10 issue 7 (October 1, 1998) pp. 1731-1757.

Apprentissage et estimation de paramètres.

J-P Nadal, D. Herschkowitz, (en thése) collaboration M Opper (Aston, UK)

Cette équipe a abordé divers aspects de la théorie de l'apprentissage et de l'estimation de paramètres avec les outils de la physique statistique et de la théorie de l'information. En particulier il a été établi des propriétés génériques des performances optimales théoriques dans l'estimation de paramètres en fonction de la quantité de données disponibles (ou, s'il s'agit de codage neuronal, en fonction du nombre de cellules recrutées pour coder un stimulus) (Herschkowitz et Nadal, 1999).

Un travail en collaboration avec M Opper a permis de démontrer rigoureusement l'existence d'une transition entre un régime où "on apprend beaucoup mais on ne comprend rien" (taux maximal d'augmentation de l'information, mais impossibilité de construire un estimateur), et un régime où "on apprend peu mais on généralise bien" (faible gain d'information mais bonne performance de l'estimateur optimal) (Herschkowitz and Opper, à paraitre).

Références

Unsupervised and supervised learning: the mutual information between parameters and observations, Herschkowitz D. and Nadal J.-P., Phys. Rev. E59 (1999) 3344.

Herschkowitz D., Opper M. Phys. Rev. Lett. 2001

Information processing by a noisy binary channel Network, Korutcheva E., Parga N. and Nadal J.-P., Computation in Neural Systems 8 (1997) 405

Analyse en composantes indépendantes (ACI)

 J-P Nadal, Ph. Aires (Scientifique du Contingent), collaboration N. Parga (Madrid), A. Chédin (LMD, Ecole Polytechnique), E. Korutcheva (Roumanie).

En étudiant le codage neuronal du point de vue du transfer d'information (au sens de Shannon), J.P. Nadal en collaboration avec N. Parga a démontré qu'un codage optimal minimise la redondance (au sens introduit au début des années 60 par le biologiste H Barlow), et que le résultat d'un tel codage est équivallent à ce que les ingénieurs nomment l'analyse en composantes indépendantes". Ils ont ainsi démontré que la maximisation du transfert d'information conduit à l'ACI. Ils ont montré que ce résultat est valide pour un bruit faible sur les capteurs/senseurs, et pour un traitement (un réseau) aussi bien déterministe que stochastique (Nadal and Parga 1997 ; Nadal, Brunel and Parga 1998). Par ailleurs ils ont étudié différentes approches algorithmiques permettant de réaliser l'ACI (Nadal and Parga 1997), et abordé le cas où le mélange évolue avec le temps (Parga et Nadal, 2000).

 J-P Nadal, en collaboration avec Ph. Aires (Scientifique du Contingent), A. Chédin (LMD, Ecole Polytechnique), et E. Korutcheva (Roumanie). ils ont abordé l'application de l'ACI à des problèmes rencontrés en géophysique (Aires, Chedin et Nadal 2000), et considéré des aspects pratiques liés à l'interprétation des résultats d'une ACI (Nadal, Korutcheva, Aires, 2000).

Références.

Analysis of geophysical time series and information theory: Independent Component Analysis, Aires F., Chédin A. and Nadal J.-P., CRAS IIa 328 (1999) 569.

Independent component analysis of multivariate time series. Application to the tropical SST variability, Aires F., Chédin A. and Nadal J.-P. J. Geophys. Research 105 (2000) 17

Redundancy Reduction and Independent Component Analysis: Conditions on Cumulants and Adaptive Approaches, Nadal J.-P. and Parga N., Neural Computation 9 (1997) 1421

Nonlinear feedforward networks with stochastic ouputs: infomax implies redundancy reduction Network, Nadal J.-P., Brunel N. and Parga N., Computation in Neural Systems 9 (1998) 207

Blind source separation in the presence of weak sources, Nadal J.-P., Korutcheva E. and Aires F., Neural Networks 13 (2000) 589.

Mémoire humaine.

J. Ninio, N. Brunel

La mémoire visuelle humaine est capable d'engranger un nombre énorme de stimuli, mais ne conserve de chacun d'eux qu'une information très limitée. Des expériences ont été menées pour mesurer, de manière fine, le degré de détail auquel une, deux ou N images sont mémorisées, afin de déterminer les cinétiques et les seuils de mémorisation et, de là, commencer à cerner l'architecture fonctionnelle de la mémoire humaine. Dans la procédure expérimentale que cette équipe a initiée, le sujet voit un quadrillage abstrait de n éléments noirs ou blancs. L'ayant mémorisé, il doit le retrouver dans un couple d'images présentées ultérieurement, qui diffèrent en M positions. Le nombre moyen de bits mémorisés se déduit du taux d'erreurs en fonction de M et N. La capacité de saisie, entre 300 msec et une seconde est d'environ 12 bits. Au-delà, le nombre de bits croît comme la racine carrée du temps de mémorisation. Quand on mémorise N images, il semble qu'il y ait des paliers successifs, et ceci suggère une organisation en plusieurs couches. Pour la suite, il serait souhaitable de caractériser le statut de chacune des images mémorisées dans une séquence de N images. Une différenciation de ces images selon leur rang d'acquisition ou d'extraction fournirait des indices importants quant au mode de fonctionnement de la mémoire.

Références

Time to detect the difference between two images presented side by side, Brunel, N. et Ninio, J. Cognitive Brain Research 5 (1997) 273.

Acquisition of shape information in working memory, as a function of viewing time and number of consecutive images : evidence for a succession of discrete storage classes, Ninio, J. Cognitive Brain Research 7 (1998) 57

Perception visuelle : aspects géométriques.

J. Ninio, collaboration J.K. O'Regan

Un travail systématique a été entrepris sur les illusions géométriques. En mesurant de manière fine comment une illusion varie avec l'angle de présentation, on attache à chaque illusion une sorte de signature qui permet ensuite, par comparaison, de comprendre les liens de filiation entre les illusions, et d'introduire ainsi une classification objective dans un champ de phénomènes trop souvent présenté comme un catalogue de bizarreries. Après un premier travail sur les illusions de la famille Zöllner, publié en 1996, J. Ninio s'est attaqué aux illusions de la famille Poggendorff, a montré qu'elles étaient sans rapport avec les précédentes, et qu'à l'intérieur de cette famille, la force de chaque variant s'expliquait par une combinatoire d'effets élémentaires. A terme, cette équipe devrait pouvoir réduire toutes les illusions d'orientations et d'alignements à quelques principes simples. Il restera ensuite à caractériser les illusions de type métrique.

A signaler également, dans le cadre de la vision stéréoscopique, une étude sur les a priori du cerveau, quand il assigne une courbure en profondeur à des arcs, en absence de tout indice.

Références

Characterisation of the misalignment and misangulation components in the Poggendorff and corner-Poggendorff illusions, Ninio, J. et O'Regan, J.K. Perception 28 (1999) 949.

Curvature biases in stereoscopic vision : A nasotemporal asymmetry, Ninio, J. Perception 29 (2000) 1219

Perception visuelle : illusions de contraste.

 J. Ninio, collaboration K.A. Stevens

Dans l'illusion très classique de la grille de Hermann, de petites taches illusoires grises apparaissent aux nœuds d'un réseau carré. Pour savoir si ce phénomène était éventuellement lié à un mode de câblage neuroanatomique, le réseau de la grille de Hermann a été soumis à diverses déformations et transformations géométriques, et cela a conduit à la découverte de deux effets visuels nouveaux. D'abord, l'effet d'extinction : les grands disques noirs, dans l'illustration du haut, ont tendance à disparaître. Seuls quelques uns - là où le regard se pose, sont manifestes. Ailleurs, les allées grises paraissent continues, et démunies de disques. Ensuite, un phénomène de "lignes pulsantes". Dans la figure du bas, on voit deux familles de lignes illusoires évanescentes, à environ 30 et 120 degrés par rapport à l'horizontale. Le premier effet renvoie à des seuils de contraste qui déclencheraient l'attention en périphérie du champ visuel, et le second, à des effets de sommation sur des réponses de champs récepteurs de même orientation, mais de polarité opposée.

 

Références

Variations on the Hermann grid: an extinction illusion, Ninio, J. et Stevens, K.A. Perception 29 (2000) 1209 

Flashing lines. Ninio, J. Perception 30 (2001) sous presse.

Analyse des images naturelles

J-P Nadal, A. Turiel (postdoc) collaboration N. Parga (Madrid)

Cette équipe a analysé les propriétés statistiques des images "naturelles" (e.g. photos prises dans les bois), et montré l'existence de lois d'échelles analogues à celles des flots turbulents. Ce travail a été considérablement développé par A. Turiel, postdoc au LPS. Une approche multifractale spécifique des images naturelles a conduit à une méthode originale, décomposant l'image en bords (l'ensemble le plus singulier dans l'analyse multifractale) et en "sources" (partie régulière).

Références.

Scene dependence of the non-gaussian scaling properties of natural images, A Nevado, A Turiel and N Parga, Network 11 (2000) 131

Blind source separation with time dependent mixtures Parga N. and Nadal J.-P., Signal Processing 80 (2000) 2187

The self-similarity properties of natural images resemble those of turbulent flows, Turiel A., Mato G., Parga N. and Nadal J.-P. Phys. Rev. Lett. 80 (1998) 1098.

The multi-fractal structure of contrast changes in natural images: from sharp edges to textures, A Turiel and N Parga, Neural Computation 12 (2000) 763.

Multiscaling and information content of natural color images, A Turiel, N Parga, D Ruderman and T Cronin, Phys. Rev. E 62 (2000) 1138

Multifractal wavelet filter of natural images, A Turiel and N Parga, Phys. Rev. Lett. 85 (2000) 3325

Application des méthodes de la Physique Statistique aux systèmes socio-économiques

G Weisbuch, Duchateau-Nguyen, J-P Nadal, O. Chenevez (stagiaire), collaborations A. Kirman (GREQUAM, Marseille), S. Solomon (Jerusalem) et D Stauffer (Cologne) ; le CEMAGREF

L'essentiel de l'activité durant ces quatre dernières années dans ce domaine a concerné l'application des méthodes de la physique statistique aux systèmes dynamiques complexes surtout dans le domaine socio-économique :

- environnement/production.

- marché de denrées périssables.

- choix sociaux.

Plus précisement, le travail concerne la structuration des marchés, ou des choix sociaux, lorsque les agents économiques ont des capacités cognitives, ou bien des connaissances, réduites par rapport aux hypothèses de rationalité illimitée de l'économie classique. Le cadre est alors celui de la "rationalité limitée", qui se traduit par des comportement routiniers (et non pas stratégiques) des agents. Le système dans son ensemble, évolue alors vers les attracteurs de la dynamique qui s'interprètent comme autant d'institutions sociales ou économiques. On explique ainsi l'émergence de structures fonctionnnelles comme les réseaux préferentiels de distribution, les dynamiques variées de l'exploitation des ressources halieutiques , les phénomenes de criticalité auto-organisées sur certains marchés au lieu des procédures d'évolution vers l'équilibre admises par les économistes classiques.

- Principe d'entropie maximum et Compromis exploration-exploitation. Il a été montré que dans un contexte de modèlisation de la prise de décision en environnement uncertain, le principe d'entropie maximum permet de justifier la fonction de choix appelée "logit" par les économistes - qui est en fait un poids de Boltzman. Ce principe a de plus une interprétation en terme de "compromis exploration-exploitation", paradigme classique dans ce domaine.

Références

Social Percolation Models, Solomon S., Weisbuch G., de Arcangelis L., Jan N., and Stauffer D. Physica A 277 (2000) 239.

Influence of capital inertia on renewable resource depletion, G. Weisbuch, E. Ann Stanley, G. Duchateau-Nguyen, M. Antona and H. Clément-Pitiot, à paraitre dans Theory in Biosciences, (1997).

Dynamical aspects in the adoption of agri-environmental measures, G. Weisbuch and G. Boudjema, Adv. Compl. Syst. 2 (1999) 11.

Environment and Institutions: a complex dynamical systems approach, G. Weisbuch Ecological Economics 34 (2000) 381

Market organization and trading relationships, G. Weisbuch, A Kirman et D. Herreiner, The Economic Journal (2000) 411.

Hits and Flops Dynamics, G. Weisbuch and D. Stauffer, Physica A 287 (2000) 563.

 Self Organized Percolation and Critical Sales Fluctuations, G. Weisbuch and S. Solomon, Int. Jour. Mod. Phys. C 11 (2000) 1263.

A formal approach to market organization: choice functions, mean field approximation and maximum entropy principle in Advances in Self-Organization and Evolutionary Economics, Nadal J.-P., Weisbuch G., Chenevez O. and Kirman A. (J. Lesourne and A. Orléan Eds., Economica, London, 1998) 149-159

 Applications of Simulation to Social Science (G. Ballot et G. Weisbuch, editeurs) ouvrage aux Editions Hermès Sciences (2000)

 Mixing beliefs among interacting agents, G. Deffuant, D. Neau, F. Amblard and G. Weisbuch, in "Applications of Simulation to Social Science" ouvrage aux Editions Hermès Sciences (2000), G. Ballot et G. Weisbuch, editeurs.